非洲豬瘟p54蛋白的表達及ELISA抗體檢測方法的建立.pdf

1、StudiesontheExpressionofAfricanSwineFeverVirusp54ProteinandEstablishment0fELISAforDetectionofAntibodies’’、’‘submittedt01heslssubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgro

2、nomy1●一一WangLiping(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：ProfQinXiaobingervlsor：ShanHuGongZhenhuaQingdaoChinaJune，2014壹魚盤些太堂亟堂僮途窒摘噩非洲豬瘟p54蛋白的表達及ELISA抗體檢測方法的建立摘要非洲豬瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African

3、swinefevervirus，ASFV)弓l起的豬的一種急性、熱性傳染病，該病發(fā)病率高，死亡率從5％到100％不等，世界衛(wèi)生組織將其列為必須要報告的動物疫病之一。自1921年ASF在肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)以來，目前已在非洲、歐洲和美洲等約49個國家報道發(fā)生過ASF疫情。2007年，與我國接壤的俄羅斯爆發(fā)ASF，目前陸續(xù)有14個州爆發(fā)過ASF，若繼續(xù)蔓延，我國不排除傳入ASF的可能。ASF的蔓延速度非?？欤瑑H最近1年，就有包括白俄羅斯、烏克蘭、

4、立陶宛在內(nèi)的三個國家首次發(fā)現(xiàn)ASF。目前，各國都在建立ASFV的快速檢測和監(jiān)測方法以控制ASF的侵入，由于我國目前尚未發(fā)現(xiàn)此病，而且國內(nèi)禁止引進外來病毒，從國外引進血清又昂貴復雜，導致我國在此病的檢測方法上明顯落后于一些發(fā)達國家。因此，利用重組ASFV抗原建立快速、安全的診斷方法，以進行技術(shù)儲備是十分必要的，對防止ASF傳入我國具有重要意義。本研究旨在原核表達非洲豬瘟病毒(ASFV)p54蛋白，并進一步建立p54間接ELISA方法，用于

5、ASFV的診斷。1參考非洲豬瘟病毒Con09／Bzz020株p54基因(E183L)的核苷酸序列，通過序列優(yōu)化后合成p54基因，克隆至表達載體pET30c()，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30c()一p54。結(jié)果顯示，pET30c()p54有完整的閱讀框架，可表達分子量約21kDa的p54蛋白，該蛋白表達穩(wěn)定，具有可溶性，易于純化，純度為95％，濃度高達800tg／mL，所表達的p54蛋白的氨基酸序列與Con09／Bzz020株p54蛋白氨基酸序

6、列相同；Western—blot試驗顯示，表達的p54蛋白能與ASFV標準陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。研究結(jié)果證實p54蛋白表達產(chǎn)量高，易于純化，具有較好的抗原性，可用于非洲豬瘟ELISA診斷。2利用純化的p54重組融合蛋白作為抗原，進行p54抗體檢測間接ELISA方法的建立。對ELISA反應(yīng)的條件進行了優(yōu)化，確定抗原p54的包被濃度為12599／mL；血清稀釋度為1：50；最佳包被條件為37“Clh4。C過夜；最適封閉液為5％的脫脂奶粉；