HIF-1α小型干擾RNA抑制泡沫細(xì)胞形成及洛伐他汀對HIF-1α表達(dá)影響的體外研究.pdf

1、研究背景：氧化修飾低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LDL是引起動(dòng)脈粥樣硬化的重要物質(zhì)，越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激、巨噬細(xì)胞大量攝取OX-LDL及泡沫細(xì)胞形成可導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)形成。 AS炎癥學(xué)說認(rèn)為AS是一個(gè)慢性炎癥過程，在諸多引起內(nèi)皮損傷的有害刺激中，OX-LDL起關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)報(bào)道在正常氧條件下OX-LDL是通過氧化

2、還原調(diào)節(jié)途徑引起人巨噬細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1a (hypoxia-inducible factor-1a,HIF-1a)蛋白積累，提示HIF-1 a可能在AS和OX—LDL所致的病理狀態(tài)中起作用。HIF-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)在髓系細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥中是必需的，是炎癥細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。HIF-1是由α亞基和β亞基組成的異二聚體，其中HIF-1a蛋白是HIF-1DNA結(jié)合活性的主要決定因素，

3、為具有廣泛作用的重要調(diào)節(jié)因子。因此，抑制HIF-1a表達(dá)將是研究HIF-1a依賴動(dòng)脈硬化進(jìn)程，干擾缺氧誘發(fā)病理改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。 方法：HIF-1a型干擾RNA(HIF-1a-siRNA)被認(rèn)為是研究HIF-1a相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和缺氧誘發(fā)生理變化的最好工具。本研究將HIF-1a-siRNA加入人單核細(xì)胞株系U937細(xì)胞中，采用油紅染色檢測泡沫細(xì)胞的形成，并用基因芯片法來觀察OX-LDL刺激后對巨噬細(xì)胞基因表達(dá)變化，根據(jù)基因芯片檢測

4、結(jié)果，用Real—timePCR驗(yàn)證了與AS密切相關(guān)的6種基因及HIF-1amRNA的表達(dá)，用Western blot驗(yàn)證了與AS密切相關(guān)的4種基因及HIF-1a蛋白的表達(dá)。同時(shí)采用Real-time PCR及Western blot來檢測洛伐他汀(10vastatin)對HIF-1a表達(dá)的影響。 結(jié)果：正常巨噬細(xì)胞不含高濃度脂肪滴，因此不會(huì)被特異性脂肪滴染料油紅染色。培養(yǎng)的U937細(xì)胞及HIF-1a-siRNA轉(zhuǎn)染載體I轉(zhuǎn)染的

5、U937細(xì)胞分別用40mg/L OX-LDL刺激，24 h后進(jìn)行油紅染色。結(jié)果顯示：未加OX-LDL刺激的U937細(xì)胞未見泡沫細(xì)胞形成；正常U937細(xì)胞加入ox-LDL刺激24 h后，全部轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞；HIF-1a-SiRNA轉(zhuǎn)染載體I轉(zhuǎn)染的u937細(xì)胞加TY 入OX-LDL刺激24 h后，雖有部分泡沫細(xì)胞形成，但其形成量顯著低于未轉(zhuǎn)染組。基因芯片結(jié)果顯示：用OX-LDL刺激后，與動(dòng)脈硬化相關(guān)的96個(gè)基因中，有70個(gè)上調(diào)；在進(jìn)行HIF

6、-1a-siRNA干擾后，這70個(gè)基因中，有57個(gè)下調(diào)。 Real-time PCR結(jié)果顯示：在培養(yǎng)的U937細(xì)胞中，加入40mg/L OX-LDL可引起細(xì)胞間粘附分子-l (intercellular adhesion molecule-1，ICAMl)、血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAMl)、血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin-like OX-LDL r

7、eceptor,LOXl)、環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2.COX-2)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、低密度脂蛋白受體(LDL receptor,LDLR)及HIF-1amRNA表達(dá)顯著升高，而用HIF-1a-siRNA預(yù)處理過的細(xì)胞加入OX-LDL，其表達(dá)與單純OX-LDL組相比顯著下調(diào)(P<0.05)，該結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。 Western blot結(jié)果顯示:在培養(yǎng)的U9

8、37細(xì)胞中，加入40mg/L OX-LDL可引起ICAM1、VCAM1、COX-2、IL-1β及HIF-1a蛋白的表達(dá)顯著升高，而用HIF-1a-siRNA預(yù)處理過的細(xì)胞加入OX-LDL，其表達(dá)與單純OX-LDL組相比顯著下調(diào)(P<0.05)，該結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。 洛伐他汀與培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞U937共孵育，用40 mg/L OX-LDL刺激細(xì)胞，觀察藥物對細(xì)胞HIF-1a表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：OX-LDL刺激下，U937細(xì)胞

9、中HIF-1a表達(dá)量顯著升高，加入洛伐他汀后，HIF-1 a的表達(dá)量顯著降低，隨劑量增加，抑制作用顯著增強(qiáng)，有明顯的劑量依賴關(guān)系。Western blot結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果相似。 結(jié)論：OX-LDL氧化損傷導(dǎo)致巨噬細(xì)胞HIF-1a高表達(dá)，是促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵步驟；HIF-1a-siRNA可通過抑制HIF-1a表達(dá)來調(diào)控與AS相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制泡沫細(xì)胞的形成；洛伐他汀可抑制巨噬細(xì)胞HIF-1a的表達(dá)。