ADMA對MPP+損傷PC12細胞的拮抗作用及機制.pdf

1、研究背景與目的：
　　1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-Tetrahydro pyridine, MPTP)的毒性代謝產(chǎn)物1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+）被多巴胺轉(zhuǎn)運體選擇性攝取積聚于線粒體中，特異性抑制復合體I(complex I)，引起氧化磷酸化的崩解，導致 Ca2+內(nèi)流，從而激活一氧化氮合酶

2、(Nitric oxide synthase, NOS)，導致一氧化氮(Nitric oxide, NO)的大量產(chǎn)生。NO與線粒體內(nèi)產(chǎn)生的過氧化物作用生成過硝酸鹽，從而引起蛋白質(zhì)、類脂質(zhì)化合物和DNA的氧化，最終導致多巴胺能神經(jīng)元的死亡。NOS的過度激活和NO的大量生成是MPP+神經(jīng)毒性的重要原因。
　　非對稱性二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine, ADMA)是一種內(nèi)源性 NOS抑制劑，在體內(nèi)是通

3、過蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein-arginine methyltransferase, PRMT)催化某些蛋白質(zhì)的精氨酸殘基發(fā)生甲基化，進而在蛋白水解酶的作用下水解而生成。ADMA可以選擇性的抑制 NOS合酶的三種亞型(iNOS, nNOS,和eNOS)，并減少 NO的生成。我們是否可以利用ADMA對 NOS活性的抑制作用而對抗 MPP+誘導的神經(jīng)毒性呢？盡管ADMA已被公認為心血管疾病和慢性腎臟疾病的危險因子，我們推測 ADM

4、A可通過抑制NO的生成，而對 MPP+的神經(jīng)毒性可起到相應的保護作用。
　　為此，本研究將建立 MPP+損傷 PC12細胞的帕金森病細胞模型，探討ADMA對MPP+神經(jīng)毒性作用的影響及其機制。
　　方法：
　　1.臺盼藍拒染色法觀察PC12細胞的存活率；
　　2. Hoechst33258染色后，熒光顯微鏡下觀察PC12細胞核染色體形態(tài)改變以檢測細胞凋亡；
　　3.羅丹明123(Rhodamine123,

5、Rh123)染色后，熒光顯微鏡檢測細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)；
　　4.2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)染色后，熒光顯微鏡及流式細胞儀(Flow cytometry, FCM)檢測細胞內(nèi)活性氧(Reactive oxide species, ROS)水平；
　　5. NOS試劑盒檢測細胞內(nèi)NOS活性；
　　6. NO試劑盒檢測細胞培養(yǎng)基中N

6、O的水平；
　　7.亞甲基藍比色法檢測 PC12細胞培養(yǎng)上清液中 H2S含量和細胞 CBS的活性；
　　8. Western Blot檢測PC12細胞內(nèi)Cyt-c、Bcl-2、PON1和CBS蛋白的表達狀況。
　　結(jié)果：
　　1. ADMA對MPP+損傷PC12細胞的拮抗作用
　　ADMA(40~320μmol/L)能濃度依賴性地降低2 mmol/L MPP+對PC12細胞活力的抑制作用；320μmol/L

7、 ADMA能減輕 MPP+(2 mmol/L)引起的PC12細胞形態(tài)學病變和細胞凋亡，表明 ADMA可拮抗 MPP+的神經(jīng)毒性。
　　2. ADMA抗MPP+神經(jīng)毒性的機制
　　2.1 ADMA的抗MPP+神經(jīng)毒性作用可能與其遏制MPP+過度激活NOS和促進NO過度生成有關
　　2 mmol/L MPP+可顯著升高 NOS的活性，促進 NO量生成；提前30 min給予320μmol/L ADMA，MPP+誘導的NOS活

8、性和NO水平明顯被減弱，表明 ADMA可通過遏制 MPP+過度激活 NOS，進而抑制 NO過量生成而對抗 MPP+的神經(jīng)毒性。
　　2.2減輕 MPP+對內(nèi)源性 H2S生成的抑制作用可能涉及到ADMA的抗MPP+機制
　　2 mmol/L MPP+可使細胞內(nèi) CBS蛋白表達和CBS的活性均明顯降低，320μmol/L ADMA預處理 PC12細胞30 min，則可顯著抑制 MPP+對細胞內(nèi) CBS蛋白表達和CBS活性的下降，

9、表明 ADMA對抗 MPP+的神經(jīng)毒性可能與改善細胞內(nèi) CBS的蛋白表達和活性有關。
　　2 mmol/L MPP+降低細胞培養(yǎng)液中 H2S的含量，320μmol/L ADMA預處理 PC12細胞30 min，則可顯著抑制 MPP+對細胞培養(yǎng)液中 H2S含量的降低作用，表明 ADMA能夠減輕 MPP+對內(nèi)源性 H2S生成的抑制作用。
　　320μmol/L ADMA可顯著減輕2 mmol/L MPP+對 PC12細胞的損傷作

10、用；而 CBS特異性阻斷劑胺基氧丙酮（amino-oxyacetate, AOAA）在抑制內(nèi)源性 H2S生成后可削弱 ADMA對 PC12細胞的保護作用。以上結(jié)果表明ADMA對抗 MPP+的神經(jīng)毒性作用可能與其改善內(nèi)源性 H2S水平有關。
　　2.3 ADMA對抗 MPP+的神經(jīng)毒性可能與其上調(diào) PON1蛋白的表達有關
　　320μmol/L ADMA可減輕2 mmol/L MPP+對 PC12細胞對氧磷酶-1(Paraox

11、onase-1, PON1)蛋白表達的抑制作用，2-羥基喹啉(2-Hydroxy-4-methylquinoline,2-HQ)特異性抑制 PON1后，可抑制 ADMA對細胞興奮性損傷的保護作用，表明 ADMA可通過降低 MPP+對 PON1蛋白表達的抑制作用而減輕 MPP+的毒性作用。
　　2.4 ADMA減輕MPP+作用后PC12細胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累
　　2 mmol/L MPP+處理能引起細胞內(nèi) ROS的積聚，

12、320μmol/L ADMA自身并未明顯改變細胞內(nèi) ROS水平，但可顯著降低 MPP+誘導的PC12細胞內(nèi) ROS水平。FCM定量分析亦表明 ADMA抑制 MPP+誘導 ROS堆積。
　　2.5 ADMA可通過干預 MPP+誘導的細胞線粒體凋亡途徑對抗 MPP+的神經(jīng)毒性
　　通過Rh123染色檢測細胞內(nèi) Rh123的熒光強度來反映細胞線粒體膜電位(MMP)的水平，我們發(fā)現(xiàn)2 mmol/L MPP+可使 PC12細胞內(nèi) Rh

13、123的熒光強度明顯減弱，表明 MPP+能顯著降低細胞 MMP的水平；320μmol/L ADMA本身并未明顯影響細胞內(nèi) MMP，但可顯著抑制 MPP+降低 PC12細胞的MMP水平。
　　MPP+(2 mmol/L)可下調(diào) PC12細胞 Bcl-2蛋白的表達水平，而320μmol/L ADMA預處理30 min可抑制 MPP+對 Bcl-2蛋白表達的下調(diào)作用，表明 ADMA的抗 MPP+神經(jīng)毒性作用與其逆轉(zhuǎn) MPP+對 Bcl-

14、2蛋白表達的下調(diào)作用有關。
　　MPP+(2 mmol/L)可使 PC12細胞細胞色素C(Cytochrome C, Cyt-c)表達增加，而320μmol/L ADMA預處理30 min可抑制 MPP+對 Cyt-c表達的上調(diào)作用，表明 ADMA可通過抑制 MPP+激活 Cyt-c而對抗 MPP+的神經(jīng)毒性作用。
　　結(jié)論：
　　ADMA對 MPP+誘導 PC12細胞的神經(jīng)毒性具有拮抗作用。ADMA抗MPP+損傷 P