BCNU-PLGA緩釋微球制備及其對(duì)鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是擺在神經(jīng)外科醫(yī)師面前的一個(gè)難題。常規(guī)手術(shù)加全身化療和放療等措施雖然有效，但效果并不令人滿意。患者術(shù)后的平均生存期不超過一年，復(fù)發(fā)率也極高?？ǖ?卡莫司汀，1，3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BCNU)是最常使用的腦膠質(zhì)瘤化療藥物，具有脂溶性和相對(duì)低分子量，可以通過血腦屏障。但BCNU靜脈給藥，可發(fā)生一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥如骨髓抑制、肝毒性、肺纖維化等，治療效

2、果受到很大限制。臨床觀察發(fā)現(xiàn)90％的惡性膠質(zhì)瘤在原發(fā)腫瘤邊緣2cm范圍內(nèi)復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移少見，基于腦膠質(zhì)瘤的這種特殊生物學(xué)行為，研究者們的目光集中到了局部給藥系統(tǒng)。在腫瘤局部植入生物可降解聚合體為載體的緩釋劑型化療藥物，達(dá)到高濃度、長(zhǎng)時(shí)效釋放化療藥物的目的，直接作用于腫瘤細(xì)胞，繞過血腦屏障的限制，降低了全身毒性，為膠質(zhì)瘤的治療開辟了一個(gè)新的、充滿希望的途徑。 聚乳酸-羥基乙酸(poly-Lactide-co-Glycolide，P

3、LGA)是由乳酸(lacticacid，LA)和羥基乙酸(glycolicacid，GA)經(jīng)縮聚反應(yīng)形成的共聚物，由聚乳酸PLA和羥基乙酸GA按一定的比例通過酯鍵連接聚合而成，在體內(nèi)代謝時(shí)首先被降解為乳酸和羥基乙酸，最終被完全降解為C02和H20排出體外，與人體有良好的生物相容性。PLGA的降解反應(yīng)屬水解反應(yīng)，降解速度取決于乳酸與甘醇酸的比例、聚合體的分子量、透明度及玻璃轉(zhuǎn)化溫度Tg。在體內(nèi)和體外PLGA在液體環(huán)境中的降解都是通過酯鍵連

4、接的斷裂，以均一的速度在整個(gè)聚合體鏈進(jìn)行整體分解，在此過程中伴隨著游離羧基末端的形成，酯鍵水解后隨羧基末端的增加而酸性增加，對(duì)水解反應(yīng)產(chǎn)生自身催化的效果。PLA及PLGA由于良好的生物降解性與生物相容性，臨床已有較廣泛的應(yīng)用，如手術(shù)縫合線、骨折內(nèi)固定器材等，安全性和生物相容性良好，近年逐步應(yīng)用到藥物載體。 本研究利用四種不同分子量和LA/GA比值的可降解聚合體PLGA為載體，利用溶劑揮發(fā)-萃取法制備了BCNU-PLGA緩釋劑微球

5、，通過對(duì)微球形態(tài)、直徑的考查，選擇了適合的PLGA材料，微球直徑29.16±14.37μm，包封率在50-60％之間，在此基礎(chǔ)上以正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)微球制備過程中的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，對(duì)可能的影響因素包括不同聚合度的聚乙烯醇(poly(vinylalcohol)，PVA)、PVA濃度、PLGA濃度、攪拌速度、甲基纖維素(methylcellulose，MC)濃度進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)影響微球質(zhì)量的因素，順序從大到小依次為：PVA濃度、PLGA濃

6、度、攪拌時(shí)間和MC濃度(A-B-D-C)。最佳實(shí)驗(yàn)方案為A2B1C2D3，即分散介質(zhì)PVA濃度為1.5％，有機(jī)相中PLGA濃度為2％，攪拌時(shí)間為60min，MC濃度為0.05％。以電子顯微鏡觀察微球表面及剖面形態(tài)，證實(shí)BCNU包裹在微球內(nèi)部，高效液相色譜分析顯示藥物在微球內(nèi)部保持穩(wěn)定狀態(tài)。以頂空色譜法測(cè)定二氯甲烷殘留量3‰，低于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道。以自制工具壓成片形，加工的膜片規(guī)格為圓形，直徑3mm，厚1mm，質(zhì)量10.0±0.24mg。

7、 在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，以高效液相色譜(Highperformanceliquidchromatography，HPLC)方法測(cè)定緩釋微球的藥物釋放，發(fā)現(xiàn)BCNU-PLGA微球有明顯的延遲釋放現(xiàn)象，藥物釋放時(shí)間可達(dá)到3w，尤其在24h以后的釋放階段中較為明顯，24h釋放百分比分別為4.34％，50％釋放時(shí)間為8.43d。在體內(nèi)釋放實(shí)驗(yàn)中，微球釋放時(shí)間較體外釋放時(shí)間縮短，約為2w，24h釋放百分比分別為16.06％，50％釋放時(shí)間為2.1

8、4d。以3H標(biāo)記BCNU制備微球置入大鼠體內(nèi)，以放射液閃方法測(cè)定腦組織及血清中的藥物濃度，顯示植入側(cè)藥物濃度明顯高于對(duì)側(cè)及血清濃度達(dá)6-70倍，藥物的彌散距離達(dá)到8mm左右，并在2w時(shí)間內(nèi)維持穩(wěn)定的局部有效濃度，既在局部提供了高藥物濃度，又避免了藥物的毒副作用。HE染色分析PLGA空白緩釋微球植入大鼠腦組織后的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)緩釋微球只引起炎性細(xì)胞反應(yīng)和膠質(zhì)細(xì)胞增生，充分證明PLGA材料的生物相容性，并且不引起全身或神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應(yīng)，證明該聚

9、合體可以安全的植入腦組織中作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)間質(zhì)內(nèi)藥物傳遞的載體。 建立了HPLC法測(cè)定BCNU緩釋微球載藥量的方法，該方法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確。在本色譜條件下，載體、載體的水解產(chǎn)物、BCNU均能實(shí)現(xiàn)很好的分離，BCNU的檢測(cè)不受干擾。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積為縱坐標(biāo)，求得直線回歸方程為y=3426.4x-8.91，r=0.9992。BCNU在0.005～0.35μmol/ml范圍內(nèi)檢測(cè)線性良好，最低檢測(cè)限為0.005μm

10、ol/ml。 以BCNU-PLGA緩釋微球的浸出液作用于體外培養(yǎng)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，考察緩釋微球浸出液對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用。發(fā)現(xiàn)緩釋微球可以引起明顯的細(xì)胞壞死和凋亡，不同載藥量緩釋微球引起的細(xì)胞死亡率由5.35±1.99％上升到20.15±2.96％，晚期凋亡率由4.25±1.11％上升到32.33±2.62％，細(xì)胞早期凋亡率由6.44±0.57％上升到21.82±3.04％，細(xì)胞周期隨之變化，G0G1期細(xì)胞上升，S期細(xì)胞比例降

11、低，增殖指數(shù)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)BCNU緩釋微球作用的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目較未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組減少，有部分細(xì)胞可見凋亡表現(xiàn)，表現(xiàn)為細(xì)胞首先變圓，凝縮，體積縮小。凋亡細(xì)胞呈單個(gè)分布或數(shù)個(gè)聚集，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核濃聚縮小、深染，呈深紫色，核染色質(zhì)呈月牙形聚集于核膜下，胞質(zhì)少。Hoechst33258染色熒光顯微鏡觀察可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核固縮，染色加深，并有核碎裂、大小不等的圓形小體，包膜完整，出現(xiàn)凋亡小

12、體；對(duì)照組僅有少量的凋亡細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞在用BCNU緩釋微球浸提液處理后，電鏡下可見典型的凋亡形態(tài)特征：核濃縮、染色質(zhì)邊集或核碎裂，而細(xì)胞膜、核膜及線粒體形態(tài)保持完整。MTT實(shí)驗(yàn)顯示隨著藥物釋放時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)C6細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。24h后對(duì)照組C6細(xì)胞光密度值(opticaldensity，OD)值為2.16±0.01。藥物處理組細(xì)胞OD值分別為：0.85±0.04、0.93±0.02、1.07±0.06、1.22±0.09、1