頭頸鱗狀細(xì)胞癌中NiR-21的表達(dá)及常見microRNA單核甘酸多態(tài)性的初步研究.pdf

1、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HeadandNeckSquamousCellCarcinoma,HNSCC）是一類發(fā)生于口腔、口咽部、喉咽部及喉部的鱗狀細(xì)胞癌，其組織來源上呼吸消化道的粘膜上皮細(xì)胞。頭頸鱗狀細(xì)胞癌在世界范圍內(nèi)是第5大常見惡性腫瘤。吸煙飲酒被認(rèn)為是頭頸腫瘤最重要的危險因子。除煙酒外，人乳頭狀瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染可能是另外一種重要的病因因子。盡管近些年來，目前包括手術(shù)，放療及化療的綜合治療被運(yùn)用以改

2、善HNSCC的無病生存率，但進(jìn)展期的HNSCC患者的5年生存率僅僅徘徊在30％左右。因此，很有必要進(jìn)一步了解HNSCC的生物機(jī)制并識別預(yù)測分子標(biāo)記物，這將有助于對疾病的早期診斷，個體化治療及引導(dǎo)新的治療方案的發(fā)展和評估。在過去的幾十年里，腫瘤研究者主要集中在對蛋白編碼基因的研究，包括癌基因和抑癌基因。但最近，作為非編碼RNA基因產(chǎn)物microRNA已經(jīng)引起了研究者的重視。
　　 MicroRNAs是一種內(nèi)源性的遺傳上高度保守的大

3、約22個堿基長度的單鏈非編碼小分子RNA分子。通過與其靶點(diǎn)信使RNA的3’-端非編碼區(qū)的堿基完全配對或者不完全配對結(jié)合，導(dǎo)致目的信使RNA的切除或者轉(zhuǎn)錄抑制，從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。MicroRNAs作為一類新發(fā)現(xiàn)基因調(diào)節(jié)因子，在廣泛的生理病理活動中扮演著重要的角色，例如細(xì)胞增生、分化、凋亡、免疫/炎癥應(yīng)答系統(tǒng)、應(yīng)急耐受和代謝等。盡管microRNA準(zhǔn)確的生物作用機(jī)制依然未被完全揭示，但大量研究已經(jīng)證實(shí)microRNAs可能作為腫瘤癌

4、基因或抑癌基因通過影響細(xì)胞的生長發(fā)展參與人類腫瘤的形成，同時microRNA表達(dá)的改變與HNSCC等很多腫瘤病因?qū)W，診斷、發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。
　　 MiR-21是癌癥研究中最常見的microRNAs之一，它在很多實(shí)體腫瘤中表達(dá)上調(diào)。例如乳腺癌、肺癌、胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、膽管癌和胰腺內(nèi)分泌腫瘤等。MiR-21高表達(dá)在頭頸腫瘤中也被觀察到。因?yàn)閙icroRNA表達(dá)具有組織特異性，因此它的表達(dá)情況能潛在地暗示HNSCC亞

5、型之間的生物學(xué)通路/機(jī)制的不同。磷酸酶張力蛋白同源物(Phosphataseandtensinhomologue，PTEN)在腫瘤的形成過程中扮演著重要角色，同時PTEN表達(dá)降低與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級、腫瘤的TNM分期及微血管密度密切相關(guān)。一些研究報(bào)道顯示PTEN參與調(diào)節(jié)腫瘤的放療敏感性及化療敏感性。更重要的是，最近有研究顯示PTEN在肝癌細(xì)胞株及一些腫瘤組織中可能是MiR-21的一種靶基因。但在喉鱗狀細(xì)胞癌(LaryngealSq

6、uamousCellCarcinoma,LSCC)和喉咽鱗狀細(xì)胞癌(HypopharyngealSquamousCellCarcinoma,HSCC)中MiR-21的表達(dá)與PTEN表達(dá)之間的關(guān)系尚未報(bào)道。在本研究研究中，我們首次研究了在LSCC和HSCC中MiR-21和PTEN的表達(dá)以及他們之間關(guān)系，從而使我們更進(jìn)一步了解MiR-21在LSCC和HSCC形成及發(fā)展過程中的作用。
　　 研究證實(shí)HPV感染是HNSCC一個重要的發(fā)病

7、因子，尤其是在口-口咽鱗狀細(xì)胞癌(OralSquamousCellCarcinoma,OSCC)中。更重要的是，在對感染的固定免疫應(yīng)答及適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中，MicroRNAs參與調(diào)節(jié)免疫/炎癥應(yīng)答系統(tǒng)及凋亡通路。值得注意的是，免疫/炎癥應(yīng)答系統(tǒng)及凋亡通路在HPV的清除及免疫逃逸過程中伴有重要角色。因此，microRNAs的某種基因改變可能影響HPV狀態(tài)和對OSCC的易感性。
　　 在microRNAs分子內(nèi)部或者他們的鏈接位點(diǎn)

8、上當(dāng)單核甘酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)可能對pri-microRNA模板的轉(zhuǎn)錄過程，microRNA前體加工成熟microRNA的過程或microRNA與其靶點(diǎn)基因的相互作用過程產(chǎn)生影響。據(jù)我們所知，在microRNA分子內(nèi)部及與其相結(jié)合的靶點(diǎn)基因上的一些microRNA單核苷酸多態(tài)性對microRNA的功能和他們的靶點(diǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)生重要的影響，從而導(dǎo)致腫瘤易感性。最近的研究已經(jīng)研究了包括

9、miR146rs2910164,miR149rs2292832，miR196rs11614913，andmiR499rs3746444在內(nèi)的一些microRNASNPs同HNSCC發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)系?？紤]到HPV在OSCC發(fā)生過程中的作用，我們研究血清HPV16狀態(tài)和這四種常見microRNASNPs的共同作用對OSCC發(fā)病風(fēng)險的影響。
　　 第一部分，MiR-21和PTEN在喉及喉咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義
　　

10、試驗(yàn)?zāi)康?
　　 研究MiR-21和PTEN在喉及喉咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，并分析它們的表達(dá)情況同患者臨床特征之間的關(guān)系以及它們的表達(dá)情況兩者之間的關(guān)系。
　　 試驗(yàn)方法:
　　 1.收集60例原發(fā)性HNSCC腫瘤組織（30例LSCC和30例HSCC），并收集距離腫瘤切緣2cm以上的形態(tài)學(xué)正常的臨近正常粘膜作為對照。
　　 2.TRIzol法分別提取腫瘤組織和正常粘膜組織中的富含小RNA的總RNA。

11、　　 3.用TaqmanmicroRNA試劑盒及ABI7900HTSequenceDetectionPCR儀器通過Real-timeRT-PCR方法檢測MiR-21在腫瘤組織和臨近正常粘膜組織中的表達(dá)情況。
　　 4.免疫組織化學(xué)染色被用于檢測PTEN在60例腫瘤組織和60例臨近正常粘膜組織中的表達(dá)情況。
　　 5.統(tǒng)計(jì)分析用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。MiR-21的相對表達(dá)用均數(shù)（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。在腫

12、瘤組織中和臨近正常粘膜之間的MiR-21和PTEN的不同表達(dá)分別用配對t檢驗(yàn)和Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)。兩組樣本間的比較分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。多組間的比較采用單向方差分析或Kruskall-Wallis檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)，當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.在LSCC和HSCC腫瘤組織中MiR-21的表達(dá)水平明顯高于非腫瘤組織(P＜0.05)。上調(diào)

13、表達(dá)的MiR-21同臨床分期(P=0.001)，腫瘤大小(P=0.007)，病理特征(P=0.025)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)相關(guān)。
　　 2.在LSCC和HSCC腫瘤組織中PTEN的免疫組化染色明顯弱于其臨近的正常粘膜組織(P＜0.05)，其下調(diào)表達(dá)的PTEN同腫瘤分期(P=0.025)，腫瘤大小(P=0.017)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.040)相關(guān)。
　　 3.在LSCC和HSCC腫瘤組織中的MiR-21的表達(dá)與

14、PTEN的表達(dá)成負(fù)性相關(guān)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　 1.MiR-21可能在LSCC和HSCC的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要的角色。
　　 2.PTEN在LSCC和HSCC中表達(dá)下調(diào)。
　　 3.在LSCC和HSCC腫瘤組織中的MiR-21的表達(dá)與PTEN的表達(dá)成負(fù)性相關(guān)。
　　 第二部分，MicroRNA單核苷酸多態(tài)性增加HPV16相關(guān)的口咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　

15、 證實(shí)microRNA單核甘酸多態(tài)性可能改變血清HPV16狀態(tài)同OSCC發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)系的假說。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.按照頻率配對原則，325例原發(fā)OSCC的非西班牙裔白人患者及335例非癌癥正常對照被招募。所有研究參與候選人簽訂知情同意書并完成一份關(guān)于人口資料及包括吸煙飲酒狀態(tài)在內(nèi)的腫瘤危險因子的流行病問卷調(diào)查表。
　　 2.通過標(biāo)準(zhǔn)的ELISA檢測研究參與者的血清HPV16的狀態(tài)。
　　 3

16、.血液DNA提取試劑盒從3ml全血中提取基因組DNA。
　　 4.應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction-restrictionfragment-lengthpolymorphism，PCR-RFLP)擴(kuò)增包括miR146rs2910164,miR149rs2292832,miR196rs11614913,andmiR499rs3746444.的多態(tài)性在內(nèi)的片段。
　　 5.

17、用卡方檢驗(yàn)對選定的人口變量、吸煙、飲酒、microRNA基因頻率及血清HPV16不同狀態(tài)在病例組合對照組之間的分布差異進(jìn)行評估。用單因素和多因素logistic回歸分析計(jì)算其比值比（Oddsratios，ORs）和95％的置信區(qū)間(Confidenceinterval,CIs)來評估血清HPV16狀態(tài)和microRNA基因型對OSCC發(fā)病風(fēng)險的影響。我們也評估血清HPV16狀態(tài)和microRNA的基因型對OSCC發(fā)病風(fēng)險的聯(lián)合作用，同時

18、根據(jù)煙酒狀態(tài)及腫瘤位點(diǎn)對這種作用進(jìn)行分層分析。應(yīng)用SAS9.1進(jìn)行所有的統(tǒng)計(jì)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)，當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.在OSCC患者中的血清HPV16陽性比對照組中常見。
　　 2.總體上，沒有發(fā)現(xiàn)這四種常見microRNA多態(tài)性同OSCC發(fā)病風(fēng)險之間存在有統(tǒng)計(jì)意義的關(guān)系。
　　 3.同攜帶miR499rs3746444TT基因型同時血清HPV16陰性的

19、個體相比，我們發(fā)現(xiàn)攜帶miR499rs3746444CT或CC基因型同時血清HPV16陰性的個體的OSCC發(fā)病風(fēng)險增高（OR=1.4，95％CI=1.0-2.0），我們發(fā)現(xiàn)攜帶miR499rs3746444TT基因型同時血清HPV16陽性的個體的OSCC發(fā)病風(fēng)險增高（OR=3.4，95％CI=2.0-5.6），攜帶miR499rs3746444CT或CC基因型同時血清HPV16陽性的個體明顯增加OSCC發(fā)病風(fēng)險(OR=4.1，95％CI

20、=2.1-8.0)。類似的結(jié)果對于miR146rs2910164，miR149rs2292832和miR196rs11614913的多態(tài)性也存在。
　　 4.按照吸煙飲酒狀態(tài)進(jìn)行進(jìn)一步的分層分析，我們發(fā)現(xiàn)我們研究的每種microRNA多態(tài)性改變HPV16感染相關(guān)的OSCC的發(fā)病風(fēng)險，同時這種改變作用在從不吸煙人群中尤其明細(xì);同口腔鱗狀細(xì)胞癌(OralCavitySquamousCellCarcinoma,OCSCC)相比，口咽部