1型鴨肝炎病毒2C蛋白亞細(xì)胞定位及NTP酶活功能檢測(cè).pdf

1、f)蚶7f脾^‘ILIlIIlIIlIILlIlIILILIIIIlIILILIIIIIILILIIIIIIIIY3292794學(xué)弓S2Q14篁!、口iI蓑掌文學(xué)slCHu^N^6RIcuLTUR^LUNvERsITY碩j士學(xué)位論文1型鴨肝炎病毒2C蛋白亞細(xì)胞定位及NTP酶活功能檢測(cè)唐曉思指導(dǎo)教師0汪銘書(shū)教授飛r————■——————一學(xué)科專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)∥?！?，————!———————————————一研究方向1禽病學(xué)2017年5

2、月摘要鴨甲型病毒陛肝炎(DuckhepatitisAvirus1，DHAV1)屬于小RNA病毒科的成員，主要感染4周齡以下的雛鴨，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害極大。2C蛋白位于DHAV1編碼的多聚蛋白的P2區(qū)，其它小RNA病毒的研究表明，2c蛋白是一種非結(jié)構(gòu)蛋白且在病毒復(fù)制復(fù)合體的形成過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，但目前未見(jiàn)對(duì)DHAV12C蛋白特性及功能研究的報(bào)道。本文在對(duì)DHAV12C蛋白進(jìn)行原核表達(dá)的基礎(chǔ)上，制備出2C蛋白多克隆抗體，檢測(cè)了DHAV12C

3、在鴨胚成纖維(DEF)細(xì)胞內(nèi)的分布情況，同時(shí)對(duì)2C的NTP酶活性及影響酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果如下：1DH瓜，12C蛋白的表達(dá)、多克隆抗體的制備及亞細(xì)胞定位檢測(cè)將正確擴(kuò)增的2C片段連入pET32a上，成功構(gòu)建了pEY32a2C原核表達(dá)載體，將pET32a2C轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rossta(DE3)PP，IPTG誘導(dǎo)后2C以不溶生性包涵體的形式表達(dá)，Westernblot鑒定后可被組氨酸標(biāo)簽抗體識(shí)別，大小約為50kDa，純化2C蛋白

4、，免疫鼠獲得了2C蛋白的多克隆抗體。將2C片段連入pEGFPC2中，轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞，觀察2C蛋白單獨(dú)表達(dá)時(shí)在細(xì)胞中的定位『青況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24h的2C蛋白在核質(zhì)均有分布。將DHAV1感染DEF，間接免疫熒光檢測(cè)病毒增殖過(guò)程中2C蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，結(jié)果顯示：在病毒感染后4h以前2C蛋白分布在胞漿，6ll后開(kāi)始入核，20h后全部入核，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不再出核；進(jìn)一步對(duì)2C在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的亞細(xì)胞定位進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，DHA

5、V1感染DEF4h后2C蛋白可分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。2DHAV12C蛋白的NTP酶活性及酶淆陛關(guān)鍵位點(diǎn)的研究將麥芽糖結(jié)合蛋白@仍P)片段加在2C序列的N’端后連入pET28a并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rossta(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得了可溶f生的2C重組融合蛋白。Westernblot鑒定表明，2C重組融合蛋白可被組氨酸抗體識(shí)別，重組融合蛋白的大小為75kDa。純化2C鶯組融合蛋白，用磷酸檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)到原核表達(dá)的可溶性2C重組融合