軟脂酸致H9c2心肌細胞凋亡的機制研究.pdf

1、在缺血性心臟病、心肌炎、慢性心衰等心臟疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程中，心肌細胞數(shù)目減少(由心肌細胞死亡引起)或者殘存的心肌細胞功能下降，是心功能下降的主要原因。一般認為心肌細胞是終末分化細胞，心肌細胞的損傷和死亡主要通過細胞壞死，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞凋亡亦存在于心肌的生理與病理過程中，是諸多心血管疾病發(fā)生的重要細胞學基礎。資料表明，在許多心臟疾病中，飽和脂肪酸對心肌損傷起著關鍵作用，心肌細胞凋亡即為心肌損傷的主要后果之一。脂肪酸是成人

2、心臟能量產生的主要來源，在多種疾病狀態(tài)下，心肌都會出現(xiàn)脂肪酸代謝異常，如心肌急性缺血、心臟手術后脂肪酸水平可短期升高；而在糖尿病、肥胖、高脂血癥等患者脂肪酸水平則長期升高。脂質升高可伴有心肌內脂質異常蓄積，導致心肌細胞糖脂代謝紊亂，引起心肌細胞損傷，凋亡及心肌收縮和舒張功能發(fā)生改變。心臟內脂質蓄積在糖尿病和肥胖病人心衰的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。 現(xiàn)有大量的動物和細胞培養(yǎng)實驗也發(fā)現(xiàn)軟脂酸(palmitate； PAL)可誘導多

3、種細胞出現(xiàn)凋亡。但目前為止，脂肪酸引起細胞凋亡的具體分子細胞機制并不清楚。為探討軟脂酸損傷心肌細胞的機制，本文從以下三個部分進行了研究。 第一部分Pamitate對H9c2心肌細胞凋亡和NADPH氧化酶活性的影響 目的：明確palmitate致心肌細胞凋亡的最佳濃度與時間及其對心肌細胞內NADPH氧化酶亞基p47phox的影響。 方法：分組一：對照組與palmitate組(palmitate濃度分別為0.2，0.

4、5，0.8，1.2mM)。培養(yǎng)24h后觀察心肌細胞存活率、凋亡率，得到palmitate誘導心肌細胞凋亡的有效濃度。分組二：對照組與palmitate(0.5mM)組(處理時間分別為0、4、8、16、24、48h)，觀察心肌細胞存活率、凋亡率及caspase-3活性。分組三：對照組與palmitate(0.5mM)組，培養(yǎng)24h后檢測p47phox mRNA和蛋白表達的變化。 結果：1．確定palmitate0.5mM為最佳干預

5、濃度，且palmitate致心肌細胞凋亡損傷在一定范圍內呈濃度依賴性。2．心肌細胞與palmitate0.5mM共孵育16h，存活率開始顯著下降、凋亡率顯著升高(P＜0.01)；且隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞凋亡數(shù)量逐漸增多，提示palmitate誘導心肌細胞凋亡呈顯著時間依賴效應。3．與palmitate0.5mM共孵育24h后，NADPH氧化酶亞基P47phox mRNA及蛋白水平明顯增加(P＜0.05)。 結論：1．palmi

6、tate可誘導培養(yǎng)的H9c2心肌細胞發(fā)生凋亡，并對細胞凋亡率的影響呈顯著的時間依賴性。2．palmitate可引起NADPH氧化酶亞基P47phox的基因及蛋白水平的明顯上調。 第二部分 Apocynin對palmitate處理H9c2心肌細胞的影響 目的：明確NADPH氧化酶是否參與palmitate誘導的H9e2心肌細胞凋亡。 方法：實驗分為4組：對照組(Con)，apocynin組(Apo，apocynin

7、100uM)，palmitate組(Pal，palmitate0.5mM)，palmitate+apocynin組(Apo+Pal；palmitate0.5mM+apocynin100uM)。分別觀察了Apocynin對palmimte處理心肌細胞的NADPH氧化酶亞基P47phox的mRNA水平及蛋白表達、熒光顯微鏡觀察心肌細胞內ROS生成、酶標儀檢測caspase-3活性，weatern-blotting檢測心肌細胞的Bcl-2、B

8、ax及caspase-3蛋白表達。 結果： 1．Apocynin對palmimte處理的心肌細胞內NADPH氧化酶亞基P47phox基因及蛋白水平的影響：Apocynin干預palmimte培養(yǎng)H9c2心肌細胞24h后，與對照組相比，單純pal組H9c2心肌細胞內NADPH氧化酶亞基P47phox mRNA水平和蛋白表達均明顯增加，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；pal+apo組與pal組相比，P47phox mRNA水

9、平及蛋白表達明顯下降，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 2．Apocynin對palmitate處理心肌細胞ROS產生的影響：與con組相比，pal組ROS生成明顯增加；與pal組相比，pal+apo組ROS生成有所下降，陽性對照組強于pal組。 3．Apocynin對palmitate誘導H9C2心肌細胞caspase-3活性及蛋白表達的影響：與con組相比，caspase-3活性顯著增加，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05

10、)；與pal組相比，pal+apo組caspase-3活性明細下降，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)(見圖2-4)。同時caspase-3蛋白表達的變化與其活性的變化相一致均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 4．Apocynin對palmitate誘導H9C2心肌細胞bcl-2，Bax蛋白表達的影響：與con組相比，pal組Bcl-2蛋白表達明顯下調，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；與pal組相比，pal+apo組Bcl-2蛋白表

11、達有顯著改善，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。而Bax蛋白表達變化則與Bcl-2的變化相反，且均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 結論：Palmitate可誘導H9c2心肌細胞p47phox基因及蛋白水平增加，心肌細胞內ROS生成增加，抗凋亡因子Bcl-2表達下降，促凋亡基因Bax表達上調，以及Caspase-3活性明顯增加。NADPH氧化酶抑制劑apocynin可有效抑制上述改變，減少心肌內ROS生成和心肌細胞凋亡發(fā)生。

12、 第三部分MAPK及NF-kB在Palmitate致H9c2心肌細胞凋亡中的作用 目的：明確MAPK及NF-kB在Palmitate致H9c2心肌細胞凋亡中的作用。 方法：分組一：對照組(Con)，apocynin組(Apo，apocynin100uM)，palmitate組(Pal，palmitate0.5mM)，palmitate+apocynin組(Apo+Pal：palmitate0.5mM+apocynin1

13、00uM)。western-blotting檢測Apocynin對palmitate處理心肌細胞NF-kB p65蛋白水平及p-p38，p-ERK，p-JNK蛋白表達。分組二：對照組(con)，palmitate組(Pal，palmitate0.5mM)，palmitate+SB203508組(pal+p38i)，palmitate+PD98059組(pal+ERKi)，palmitate+SP600125組(pal+JNKi)。wes

14、tern-blotting檢測各組心肌細胞內Bcl-2，Bax蛋白表達以及caspase-3活性和細胞凋亡率的變化。 結果： 1．Apocynin對palmitate誘導H9c2心肌細胞P65表達的影響：與對照組相比，pal組胞核p65蛋白表達明細增強，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；與pal組相比，pal+apo組p65蛋白表達明顯下調，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，而胞漿內p65蛋白表達，各組間比較無統(tǒng)計學差異(P＞0

15、.05)。 2．Apocynin對palmitate誘導H9c2心肌細胞p-p38，p-ERK，p-JNK蛋白表達的影響：與對照組相比，pal組p-p38、P-JNK蛋白表達明細增強，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；與pal組相比，pal+apo組p-p38、p-JNK表達明顯下調，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。各組間p-ERK蛋白表達，均無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 3．MAPK抑制劑對palmitate誘導心肌細

16、胞Bcl-2，Bax蛋白表達的影響：與對照組相比，pal組抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下降，促凋亡蛋白Bax表達顯著升高，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；與pal組相比，pal+p38i組和pal+JNKi組Bcl-2蛋白表達上調，其中pal+JNKi組上調顯著，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而pal+p38i上調不明顯，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；pal+p38i組、pal+JNKi組和pal+ERKi組Bax蛋白表達均有明顯下調，有

17、統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 4．MAPK通路抑制劑對palmitate誘導H9c2心肌細胞caspase-3活性的影響：與對照組相比，pal組、pal+p38i組、pal+JNKi組caspase-3活性顯著升高，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；與pal組相比，pal+p38i組和pal+ERKi組caspase-3活性均有下降，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，pal+JNKi組caspase-3活性有明顯下降(P＜0.05)。