γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的亞群分析和誘導(dǎo)分化條件的探討.pdf

1、背景：結(jié)核?。═uberculosis，TB）一直是一個(gè)備受關(guān)注的全球性健康問(wèn)題，迄今為止，關(guān)于結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，特別是機(jī)體對(duì)結(jié)核感染的免疫機(jī)制并未完全闡明。近年來(lái)，具有天然免疫樣作用的γδ T細(xì)胞在結(jié)核感染中的免疫作用，已經(jīng)得到眾多研究者的實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察的證實(shí)。IL-17是一種重要的促炎性細(xì)胞因子，近年來(lái)研究感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）以及卡介苗感染的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，分泌IL-17

2、的細(xì)胞主要來(lái)源于γδT細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在正常人外周血中存在產(chǎn)生IL-17的γδ T細(xì)胞,而且這些細(xì)胞在結(jié)核病患者外周血中是增高的，提示產(chǎn)生IL-17的γδT細(xì)胞可能涉及TB的發(fā)病過(guò)程。雖然有研究指出，人γδ T細(xì)胞在磷酸化抗原刺激下加入誘導(dǎo)性的細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)，也可以誘導(dǎo)分泌IL-17，但Mtb多肽類抗原如Mtb耐熱抗原（Mtb-HAg）和多克隆抗體如抗TCR-γδ抗體刺激人γδT細(xì)胞后對(duì)極化細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化γδT細(xì)胞產(chǎn)生I

3、L-17有何作用和影響尚不清楚。另外，誘導(dǎo)人γδ T細(xì)胞分化的培養(yǎng)條件的研究，以及產(chǎn)生IL-17的健康人γδT細(xì)胞屬于何種亞群，也有待進(jìn)一步探討。
　　目的：探討Mtb耐熱抗原（Mtb-HAg）和抗TCR-γδ抗體在刺激人γδT細(xì)胞誘導(dǎo)分化產(chǎn)生IL-17中的作用。檢測(cè)和分析健康人γδT細(xì)胞的不同亞群經(jīng)誘導(dǎo)極化后產(chǎn)生IL-17有何不同，以探討健康人γδT細(xì)胞不同亞群產(chǎn)生IL-17的作用。
　　方法：⑴采集健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞

4、（PBMC）經(jīng)過(guò)免疫磁珠分選得到純化的γδT細(xì)胞后，加入Mtb-HAg或包被的抗TCR-γδ純化抗體，再加或不加CD28單抗進(jìn)行刺激，同時(shí)加或不加IL-17極化細(xì)胞因子組合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）誘導(dǎo)培養(yǎng)10-12 d。然后收集誘導(dǎo)極化培養(yǎng)的γδT細(xì)胞，經(jīng)PMA和Ionomycin再刺激6 h后，用ELISPOT的方法檢測(cè)產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞數(shù)。⑵采集健康人外周血濃縮白細(xì)胞（buffy coat cell）分離P

5、BMC后冷凍保存。取凍存的PBMC復(fù)蘇后經(jīng)MACS得到純化的γδT細(xì)胞，用含10％NBS或人AB血清的IMDM培養(yǎng)液或RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每孔均加入抗TCR-γδ抗體， CD28單抗以及IL-17極化細(xì)胞因子組合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)10-12 d時(shí)，收集誘導(dǎo)極化培養(yǎng)的γδT細(xì)胞，經(jīng)PMA和Ionomycin再刺激6 h后，用ELISPOT的方法檢測(cè)不同培養(yǎng)液培養(yǎng)下產(chǎn)生IL-17的細(xì)

6、胞數(shù)。⑶復(fù)蘇經(jīng)凍存的健康人的PBMC，免疫磁珠分選法分選γδT細(xì)胞，得到Vδ2+γδT細(xì)胞和Vδ2–γδT細(xì)胞兩個(gè)亞群，用含10%人AB血清的IMDM培養(yǎng)液細(xì)胞濃度后加入抗TCRγδ抗體、CD28單抗以及IL-17極化細(xì)胞因子組合（IL-1β，IL-6， TGF-β和IL-23）誘導(dǎo)培養(yǎng)10-12 d，收集細(xì)胞，經(jīng)PMA和Ionomycin再刺激6h后，用ELISPOT的方法檢測(cè)γδT細(xì)胞兩個(gè)亞群產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果

7、：①經(jīng)刺激和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的γδT細(xì)胞用ELISPOT方法檢測(cè)產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞數(shù)（每105個(gè)γδT細(xì)胞）發(fā)現(xiàn)，抗TCR-γδ+CKs組（67±33）比抗TCR-γδ組（6±3）比明顯增加（P＜0.01），抗TCR-γδ+CD28單抗+CKs組（185±54）與抗TCR-γδ+CKs組（67±33）比明顯增多（P＜0.01）。Mtb-HAg+CD28單抗+CKs組（74±41）與抗TCR-γδ+CD28單抗+CKs組（185±54）比顯

8、著減少，但與Mtb-HAg+CD28單抗組（19±12）比明顯增多（P＜0.05）。②純化的γδT細(xì)胞用含10%NBS的RPMI-1640或IMDM作為培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在相同的誘導(dǎo)極化條件下培養(yǎng)10-12 d后ELISPOT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)的組（333±46）產(chǎn)生IL-17的γδT細(xì)胞數(shù)（每105個(gè)γδT細(xì)胞）與用RPMI-1640培養(yǎng)液的組（56±38）比明顯增多（P＜0.01）。③來(lái)源于新鮮的PBMC或凍存的PBMC經(jīng)

9、免疫磁珠分選得到的γδT細(xì)胞在相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10-12 d后ELISPOT檢測(cè)，來(lái)源于新鮮的PBMC經(jīng)純化后得到的γδT經(jīng)誘導(dǎo)極化產(chǎn)生IL-17的量明顯高于比來(lái)源于凍存的PBMC（P＜0.01）。④復(fù)蘇凍存的PBMC后免疫磁珠分選得到純化的γδT細(xì)胞，分別用含10%NBS的IMDM培養(yǎng)液和含10%人AB血清的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)，在相同的誘導(dǎo)極化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10-12 d后ELISPOT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，含人AB血清的培養(yǎng)液組與含10

10、%NBS的培養(yǎng)液組相比明顯增多（P＜0.01）。⑤培養(yǎng)后Vδ2－γδT細(xì)胞中Vδ3-8亞群所占比例＞50%時(shí)，Vδ2－γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞數(shù)（1537±1193）與Vδ2+γδT細(xì)胞（579±420）相比明顯增多（P＜0.05）。而培養(yǎng)后Vδ2－γδT細(xì)胞中Vδ3-8亞群所占比例＜50%時(shí)，Vδ2－γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞數(shù)（491±745）與Vδ2+γδT細(xì)胞（1729±1315）相比明顯減少（P＜0.01）。

11、　　結(jié)論：⑴在正常健康人γδ T細(xì)胞經(jīng)Mtb-HAg或抗TCR-γδ抗體激活后，誘導(dǎo)Th17分化的細(xì)胞因子（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）也能誘導(dǎo)IL-17+γδ T細(xì)胞分化。CD28在協(xié)同抗TCR-γδ抗體激活γδT細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17的過(guò)程中也有重要作用。⑵抗TCR-γδ抗體刺激誘導(dǎo)IL-17+γδT細(xì)胞分化比Mtb-HAg的作用更強(qiáng)。⑶誘導(dǎo)人γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17時(shí)用IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)可產(chǎn)生更多的IL-17+γ