血管生成在Lewis肺癌生長轉(zhuǎn)移過程中的作用.pdf

1、背景和目的：腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多因素參與、多基因改變和多步驟演進(jìn)的復(fù)雜過程,它與腫瘤細(xì)胞本身和宿主基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用、腫瘤血管生成和宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)等有關(guān),在眾多的因素中腫瘤誘導(dǎo)的血管生成倍受重視,目前認(rèn)為它與腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系甚為密切。大量的研究證實,腫瘤在新生血管形成前,只能達(dá)到大約1-2mm3的大小,而且少有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶形成。然而在新生血管形成后,腫瘤會成倍的增長,轉(zhuǎn)移的幾率也會隨之增加。由此可知腫瘤血管生成不僅對

2、原發(fā)瘤本身的生長至關(guān)重要,同時也是腫瘤呈侵襲性生長和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必備條件。
　　腫瘤的血管生成是一個涉及基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖的復(fù)雜過程。所有這些步驟均受多種生長因子及其受體、細(xì)胞因子調(diào)控,其中血管活性調(diào)節(jié)因子(血管生成促進(jìn)因子和抑制因子)發(fā)揮著中心調(diào)控作用。當(dāng)血管生成促進(jìn)因子和抑制因子兩者間的平衡被打破時,即會啟動腫瘤血管生成的過程。
　　在各種血管活性因子中血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endotheli

3、al growth factor,VEGF)是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子,它能特異性地直接或間接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而促進(jìn)血管新生。有研究發(fā)現(xiàn),它在多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中都起到重要作用。而目前調(diào)控VEGF表達(dá)的確切機(jī)制還不甚清楚,主要認(rèn)為它可能與低氧調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)、癌基因調(diào)節(jié)等有關(guān)。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)瘤的增殖生長到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的形成要經(jīng)過漫長的過程和許多的生物學(xué)改變階段,這個進(jìn)展的過程在人體往往需要幾年甚至幾十年的時間,所以該過

4、程的觀察在人體身上不可能實現(xiàn),要完整觀察這個過程必須建立相應(yīng)的動物轉(zhuǎn)移模型,但大部分實驗動物由于其在荷瘤狀態(tài)下自身壽命的限制我們很難動態(tài)的、連續(xù)的觀察到這個過程。
　　在以往的實驗研究過程中我們發(fā)現(xiàn)將Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)細(xì)胞接種于C57BL/6近交系小鼠后,隨著腫瘤傳代次數(shù)的增加其肺轉(zhuǎn)移發(fā)生的幾率也逐漸升高,在此基礎(chǔ)上我們通過Lewis肺癌荷瘤小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代的方法模擬腫瘤在體內(nèi)生長演

5、變的過程,以期建立能夠模擬腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移動態(tài)全過程的動物模型,尋找一種觀察腫瘤生物學(xué)特征動態(tài)變化的新方法。在該動物模型建立的基礎(chǔ)上本實驗擬觀察Lewis肺癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移動態(tài)過程中腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子1a(hypoxia-inducible factor1a,HIF-1a)和微血管密度(microvesseldensity,MVD)表達(dá)的變化,以揭示血管生成與腫瘤生長轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其可能機(jī)制。

6、>　　方法：將LLC細(xì)胞接種于含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。初次接種時將LLC細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液,以1×106/0.2ml接種于C57BL/6小鼠右腋部背側(cè)皮下,建立第1代荷瘤鼠模型。以后每次將傳代2周的荷瘤鼠斷頸處死,無菌條件下剝除腫瘤組織,制成瘤細(xì)胞懸液,以1×106/0.2ml接種于C57BL/6小鼠右腋部背側(cè)皮下,在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代。分別于第2代、第8代和第15代接種C57

7、BL/6小鼠15只作為早期組、中期組和晚期組。實驗過程中觀察各組小鼠的出瘤時間,自接種后第6日起隔日一次測量腫瘤大小,計算腫瘤體積。于接種后第28天以頸椎脫臼法處死小鼠,瘤體剝離后固定并觀察其肺轉(zhuǎn)移灶情況。采用免疫組織化學(xué)法(SP法)檢測各組腫瘤組織內(nèi)MVD、VEGF和HIF-1a的表達(dá)情況,并進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)觀察。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、x2檢驗、非參數(shù)檢驗,相關(guān)分析采用二元變量的等級相關(guān)分析(Kendall

8、’stau-b),以a=0.05作為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.早、中、晚期各組小鼠的出瘤時間分別為(4.60±1.18)天、(3.73±1.03)天和(2.93±0.96)天,隨著傳代次數(shù)的增加早、中、晚期各組小鼠的出瘤時間縮短,差異有顯著性(P<0.01)。2.由早、中、晚期各組小鼠腫瘤生長曲線可以看出隨著傳代次數(shù)的增加,腫瘤的生長速度漸漸加快,差異有顯著性(P<0.05)。3.腫瘤大體觀:隨著傳代次數(shù)的增加早、中、晚期各組荷瘤

9、鼠腫瘤組織由蒼白、質(zhì)韌到紅潤、質(zhì)脆,由局限生長到浸潤皮膚導(dǎo)致皮膚破潰,浸潤胸壁肌層甚至突破胸腔,瘤組織剖開后由壞死無出血到有明顯出血。4.肺轉(zhuǎn)移灶:早、中、晚期各組小鼠的肺轉(zhuǎn)移率分別為13.3％(2/15)、60.0％(9/15)和100％(15/15),呈逐漸增高的趨勢,差異有顯著性(P<0.01)。早期組僅有兩只鏡下可見由幾十個異形腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的微轉(zhuǎn)移灶;中期組肉眼可見肺轉(zhuǎn)移灶,數(shù)目多在1-5個之間,直徑多在2mm以下,鏡下可見腫瘤

10、組織呈巢團(tuán)狀散在分布;晚期組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目從4-30個不等,直徑多在1-2mm之間,有些出現(xiàn)直徑大于2mm的轉(zhuǎn)移灶,鏡下亦見呈巢團(tuán)狀,但多發(fā),面積較大。5.早、中、晚期各組小鼠瘤組織中MVD計數(shù)分別為(24.73±10.38)、(41.27±13.50)和(55.80±21.31),隨著傳代次數(shù)的增加,肺轉(zhuǎn)移率的升高,早、中、晚期各組小鼠瘤組織中MVD計數(shù)也逐漸增多(P<0.01)。6.早、中、晚期各組小鼠瘤組織中VEGF的表達(dá)逐漸增多,

11、轉(zhuǎn)移腫瘤中VEGF的表達(dá)明顯高于無肺轉(zhuǎn)移者,差異有顯著性(P<0.05),且VEGF與MVD呈正相關(guān)(r=0.530,P<0.01)。7.早、中、晚期各組小鼠瘤組織中HIF-1a的表達(dá)逐漸增多(P<0.05),且VEGF與HIF-1a的表達(dá)成正相關(guān)(r=0.751,P<0.01)。
　　結(jié)論：1.Lewis肺癌在C57BL/6小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代過程中出瘤速度提前,生長速度加快,侵襲能力增強(qiáng),同時肺轉(zhuǎn)移發(fā)生的幾率越來越高,轉(zhuǎn)移灶數(shù)目從