黃芩素抑制人巨細(xì)胞病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　1.觀察黃芩素(baicalein，BAI)抑制HCMV體外感染人星形膠質(zhì)細(xì)胞引起的IE、pp65 mRNA及蛋白表達(dá)的變化
　　2.探討黃芩素抗HCMV感染的機(jī)制
　　方法:
　　1.差速貼壁法純化人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞;免疫熒光法標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白—膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算細(xì)胞純度。
　　2.在人

2、胚肺成纖維細(xì)胞中擴(kuò)增HCMV AD169株病毒，采用空斑定量法測定病毒滴度。
　　3.Real-Time PCR和免疫熒光檢測IE、pp65mRNA及蛋白的表達(dá)，確定HCMV是否能在人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中建立感染模型。
　　4.MTT法檢測BAI組、HCMV組、HCMV+BAI組和對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞活性，觀察BAI對(duì)HCMV感染致人星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖異常的抑制作用。
　　5.Real-Time PCR檢測不同組間(BAI+H

3、CMV組，HCMV組)星形膠質(zhì)細(xì)胞中IE及pp65mRNA的變化。
　　6.免疫熒光和Western blot檢測檢測不同組間（BAI+HCMV組，HCMV組）星形膠質(zhì)細(xì)胞中IE、UL84、pp65及乙?；M蛋白H3K9的變化。
　　結(jié)果:
　　1.分離純化培養(yǎng)得到的人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光染色后于倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞有較強(qiáng)的特異性紅色熒光，GFAP陽性率大于90％。
　　2.HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞

4、5d左右，超過80％細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，呈典型的巨細(xì)胞病毒感染后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?？瞻邷y定結(jié)果顯示病毒空斑形成單位為1×108 pfu/ml。
　　3.Real-Time PCR和western blot結(jié)果顯示HCMV感染組星形膠質(zhì)細(xì)胞可檢測到HCMV-IE和pp65的表達(dá)，而未感染組細(xì)胞則檢測不到。
　　4.MTT結(jié)果顯示，20μM BAI+HCMV組的吸光值在24 h、48 h、72 h均高于HCMV組

5、(P＜0.05)。
　　5.形態(tài)學(xué)觀察病毒感染48 h時(shí)，HCMV組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，而20μM BAI+HCMV組細(xì)胞狀態(tài)較好，CPE不明顯。
　　6.Real-time PCR結(jié)果顯示在感染48 h和72 h時(shí)20μM BAI+HCMV組IE、pp65的mRNA表達(dá)明顯低于HCMV組(P＜0.05)。
　　7.免疫熒光、Western blot結(jié)果顯示20μM BAI+HCMV組細(xì)胞的IE、UL