人MKRN1基因腺病毒siRNA載體、真核穩(wěn)定表達(dá)載體的建立及其在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。目前常規(guī)治療宮頸癌的手術(shù)，化療，放療等方法對(duì)提高患者生存率以及改善預(yù)后效果均不佳，因此，探索宮頸癌的基因治療方案已成為研究的熱點(diǎn)。穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染普通人類細(xì)胞的端粒酶能夠無限地分裂，從而證明了端粒的縮短可以控制復(fù)制衰老。Kim研究發(fā)現(xiàn)MKRN1能夠介導(dǎo)hTERT。泛素化降解，由此提示MKRN1參與腫瘤老化死亡，與腫瘤關(guān)系非常密切。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于MKRN1的研究進(jìn)展十分緩慢，有關(guān)MKRN

2、1的生物學(xué)功能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等尚不十分清楚。因此，本研究小組首先構(gòu)建了人MKRN1基因的重組siRNA腺病毒載體，轉(zhuǎn)染宮頸癌hela細(xì)胞，為今后MKRN1基因在宮頸癌細(xì)胞中的功能研究提供了有利的工具，也為在動(dòng)物整體水平方面的研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；其次構(gòu)建了真核表達(dá)MKRN1基因的載體，并在宮頸癌siha細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，從而在細(xì)胞水平探討MKRN1基因功能及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。本課題研究?jī)?nèi)容包括三個(gè)部分：
　　 1.構(gòu)建

3、人MKRN1基因重組siRNA腺病毒載體并在宮頸癌hela細(xì)胞中表達(dá)。方法：將合成的MKRN1基因的siRNA干擾序列克隆到pSES-HUS穿梭載體上，從而得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA重組載體。再將其在BJ5183感受態(tài)細(xì)菌中同源重組腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1，從而得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA重組載體；同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。腺病毒包裝HEK293細(xì)胞，并感染MKRN1陽性表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞he

4、la細(xì)胞，用RT-PCR方法及Western blotting技術(shù)檢測(cè)重組腺病毒對(duì)hela細(xì)胞中MKRN1表達(dá)的變化，用PCR-TRAP法檢測(cè)細(xì)胞中端粒酶活性的變化。結(jié)果：重組MKRN1siRNA腺病毒載體構(gòu)建成功；重組MKRN1 siRNA腺病毒感染組與對(duì)照組相比，宮頸癌hela細(xì)胞中MKRN1的表達(dá)受到顯著抑制，細(xì)胞中端粒酶的活性顯著上調(diào)。結(jié)論：重組MKRN1siRNA腺病毒載體能有效地抑制hela細(xì)胞中MKRN1的表達(dá)并上調(diào)細(xì)胞端

5、粒酶活性，從而為進(jìn)一步研究MKRN1的功能及其與腫瘤的關(guān)系提供了有效的工具。
　　 2.真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MKRN1的構(gòu)建及其在Siha細(xì)胞中的表達(dá)。方法：用RT-PCR技術(shù)從人胚腎細(xì)胞株HEK293細(xì)胞中獲得MKRN1的cDNA并將其插入真核表達(dá)載體pEGFP-N1中；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Siha細(xì)胞；G418篩選穩(wěn)定Siha細(xì)胞株；RT-PCR，Westernblot鑒定MKRN1在Siha細(xì)胞中的表達(dá)

6、。結(jié)果：RT-PCR成功地?cái)U(kuò)增出一條約1477bp的片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切電泳分析和DNA序列測(cè)定證實(shí)目的基因已插入重組質(zhì)粒，倒置熒光顯微鏡下可觀察到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞發(fā)出較強(qiáng)綠色熒光，Western blot證明人MKRN1能以融合蛋白的形式在Siha細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論：真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MKRN1成功構(gòu)建，并篩選獲得了人MKRN1基因的穩(wěn)定表達(dá)Siha細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究人MKRN1基因?qū)m頸癌Siha細(xì)胞增殖及凋亡的影

7、響提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和重要的細(xì)胞模型。
　　 3.穩(wěn)定表達(dá)MKRN1基因?qū)θ藢m頸癌Siha細(xì)胞的影響方法：利用本實(shí)驗(yàn)小組構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)MKRN1基因的Siha細(xì)胞株，觀察MKRN1基因?qū)TERT基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，端粒酶活性以及其對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果：轉(zhuǎn)染Siha細(xì)胞后，穩(wěn)定表達(dá)MKRN1明顯抑制細(xì)胞hTERT基因mRNA水平的表達(dá)，顯著抑制細(xì)胞中端粒酶的活性，并且G1期細(xì)胞顯著增加，而S期細(xì)胞明顯減少。
　　 結(jié)