乙型肝炎病毒X基因促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞增殖及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分乙型肝炎病毒X 蛋白通過MEK/ERK和PI-3K/Akt信號通路上調(diào)cyclinD1 并促進(jìn)肝臟卵圓細(xì)胞增殖
　　 第一節(jié) HBX在體外對肝臟卵圓細(xì)胞增殖的直接促進(jìn)作用
　　 目的：研究乙型肝炎病毒編碼X 蛋白在體外對肝臟卵圓細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用.
　　 方法：運(yùn)用熒光顯微鏡觀察及Western blot 對穩(wěn)定表達(dá)HBX的大鼠肝臟卵圓細(xì)胞系HBX-EGFP-LE/6 進(jìn)行鑒定。以轉(zhuǎn)染HBX細(xì)胞系HBX-

2、EGFP-LE/6 為實驗組，轉(zhuǎn)染標(biāo)記綠色熒光蛋白空載體EGFP-LE/6、LE/6細(xì)胞系為對照組，通過MTT細(xì)胞增殖活力實驗及EDU 摻入實驗比較三組細(xì)胞DNA合成速度。
　　 結(jié)果：HBX在部分細(xì)胞克隆穩(wěn)定高表達(dá)，對照組細(xì)胞未檢測到HBX表達(dá)。HBX 對肝臟卵圓細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，在同步化后培養(yǎng)24h、48h、72h，與對照組相比，HBX-EGFP-LE/6 卵圓細(xì)胞系增殖加快,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在血清刺激后，與對照組相

3、比，HBX-EGFP-LE/6 卵圓細(xì)胞系DNA合成加快,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達(dá)的HBX 蛋白對體外培養(yǎng)的肝臟卵圓細(xì)胞的增殖具有直接促進(jìn)作用，并且促進(jìn)其S 期DNA合成。
　　 第二節(jié) HBX 對卵圓細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)控作用
　　 目的：研究HBX 對肝臟卵圓細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)水平的影響，探討HBX促進(jìn)肝臟卵圓細(xì)胞增殖的分子基礎(chǔ)。
　　 方法：穩(wěn)定表達(dá)HBX基因的肝

4、臟卵圓細(xì)胞克隆為實驗組，表達(dá)綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6 卵圓細(xì)胞為對照組。Western blot 檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1、CDK2、CDK4、p21、p27的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：與對照組相比，cyclinD1的蛋白表達(dá)水平在HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞中顯著上調(diào)，p27 蛋白的表達(dá)輕微下調(diào)。
　　 結(jié)論：HBX在肝臟卵圓細(xì)胞中影響細(xì)胞周期相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平，可能是其促進(jìn)肝臟卵圓細(xì)胞增殖的分

5、子基礎(chǔ)之一。
　　 第三節(jié) HBX 對肝卵圓細(xì)胞MAPK 信號及AKT 信號的影響
　　 目的：研究HBX在卵圓細(xì)胞LE/6中對MAPK 通路信號的影響，探討HBX 促進(jìn)LE/6卵圓細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。
　　 方法：穩(wěn)定表達(dá)HBX基因的HBX-EGFP-LE/6 肝臟卵圓細(xì)胞為實驗組，表達(dá)綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6 卵圓細(xì)胞為對照組；Western blot 檢測了ERK、AKT、JNK、p38、p-ERK

6、、pAKT、p-JNK、p-p38在對照組與實驗組卵圓細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：與對照組比較，在HBX-EGFP-LE/6中，p-Erk、p-Akt的表達(dá)水平升高。但ERK、Akt、JNK、p38、p-p38、p-JNK在三種細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。
　　 結(jié)論：胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的HBX 蛋白可以在體外培養(yǎng)的肝臟卵圓細(xì)胞中上調(diào)ERK、AKT信號。
　　 第四節(jié) HBX 上調(diào)cyclinD1表達(dá)并促進(jìn)肝

7、臟卵圓細(xì)胞增殖依賴于HBX 上調(diào)的ERK 及AKT 信號
　　 目的：研究HBX 促進(jìn)卵圓細(xì)胞增殖及上調(diào)cyclinD1是否依賴于HBX-EGFP-LE/6 內(nèi)上調(diào)的ERK和/或AKT 信號。 方法：穩(wěn)定表達(dá)HBX基因的HBX-EGFP-LE/6 肝臟卵圓細(xì)胞為實驗組，表達(dá)綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6 卵圓細(xì)胞為對照組；運(yùn)用特異性信號通路抑制劑LY294002，PD184352 阻斷卵圓細(xì)胞MEK/ERK及PI-3K/Akt

8、 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后在指定時間點(diǎn)westernblot 檢測cyclinD1在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況; MTT 檢測阻斷干預(yù)72h后各組細(xì)胞的增殖活性。
　　 結(jié)果：抑制劑PD184352 阻斷通路72h后，干預(yù)組HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞較未干預(yù)組細(xì)胞增殖活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。抑制劑PD184352 阻斷通路72h后，干預(yù)組HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞較未干預(yù)組細(xì)胞增殖活性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HBX-EGFP-LE/

9、6細(xì)胞中的CyclinD1 蛋白高表達(dá)水平在兩種抑制劑分別作用后均不能維持。
　　 結(jié)論：HBX 上調(diào)的卵圓細(xì)胞增殖活性和CyclinD1表達(dá)水平，依賴于HBX 上調(diào)的ERK及AKT 信號。
　　 第二部分乙型肝炎病毒X蛋白通過影響TGFβ/smad 通路影響肝臟卵圓細(xì)胞增殖
　　 第一節(jié) HBX 降低肝臟卵圓細(xì)胞對TGFβ1 增殖抑制效應(yīng)敏感性
　　 目的：研究卵圓細(xì)胞中HBX 蛋白對TGFβ1 增殖抑

10、制效應(yīng)的影響。
　　 方法：HBX-EGFP-LE/6 卵圓細(xì)胞作為實驗組，LE/6和EGFP-LE/6 卵圓細(xì)胞作為對照組。運(yùn)用Real-time和estern blot 檢測三組卵圓細(xì)胞中TGFβ受體2 mRNA及蛋白表達(dá)水平。MTT 試驗比較外源性TGFβ1在三組卵圓細(xì)胞中的增殖抑制效應(yīng)。
　　 結(jié)果：TGFβ受體2在HBXEGFP-LE/6中的m RNA 及蛋白表達(dá)水平均下調(diào)。MTT表明外源性TGFβ1在對照組細(xì)

11、胞中具有更強(qiáng)的增殖抑制效應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：HBX 影響卵圓細(xì)胞對TGFβ1 增殖抑制效應(yīng)的敏感度，可能與TGFβ受體2的基因表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。
　　 第二節(jié)乙型肝炎病毒X 蛋白對卵圓細(xì)胞中smad2、smad3、smad4基因表達(dá)的調(diào)控作用
　　 目的：研究乙型肝炎病毒編碼X 蛋白HBX 對肝臟卵圓細(xì)胞中TGFβ/smad中核心元件samd2、samd3、samd4表達(dá)的調(diào)控作用。
　　

12、 方法：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX基因的大鼠卵圓細(xì)胞株HBX-EGFP-LE/6 作為實驗組，轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白標(biāo)記空載體的大鼠卵圓細(xì)胞株EGFP-LE/6，大鼠卵圓細(xì)胞株LE/6 作為對照組檢測TGFβ/smad 信號通路中的核心元件smad2、smad3、samd4的表達(dá)情況。Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HBX-EGFP-LE/6，以及對照組EGFP-LE/6，LE/6中smad2、smad3、smad4的mRNA表達(dá)水平，weste

13、rn blot 檢測三組細(xì)胞中smad2、smad3、smad4 蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：與對照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX基因的大鼠卵圓細(xì)胞株HBX-EGFP-LE/6中smad2的 mRNA 及蛋白表達(dá)水平未有顯著變化。Smad3、smad4的mRNA表達(dá)水平有顯著降低，Smad3 蛋白表達(dá)水平有一定程度降低，smad4 蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。
　　 結(jié)論：乙型肝炎病毒編碼X 蛋白可以在卵圓細(xì)胞中影響TGFβ/sm