雞抗菌肽Gal-13的分離提取及其對(duì)雛雞免疫的影響和作用機(jī)理研究.pdf

1、為探討雞腸道抗菌肽Gal-13對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的影響和作用機(jī)理，本研究采用蛋白分析技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫電鏡組織化學(xué)技術(shù)、ELISA技術(shù)和流式細(xì)胞及圖象分析、體外細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)，進(jìn)行了體外和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究了Gal-13對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的影響，并從TLR-NF-κB角度初步探討了Gal-13的免疫調(diào)節(jié)作用途徑。結(jié)果如下： 1.采用乙酸浸提法從雞腸道中提取抗菌肽Gal-13，再經(jīng)SephadexG-100層析，有抑菌活性的洗脫

2、產(chǎn)物經(jīng)Tricine-PAGE進(jìn)一步純化和N-末端測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：從雞腸道黏膜分離的抗菌肽是Gal-13的前片段和成熟肽，分子質(zhì)量7710Da，并制備了Gal-13的抗體。 2.與健康雛雞比較，感染IBDV的雛雞腸液、氣管液及腸道內(nèi)的Gal-13表達(dá)量明顯增多(P＜0.05)。并觀察到Gal-13主要分布在雛雞后段腸道的絨毛頂部、腸腺基部、固有層淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)，用免疫透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)Gal-13陽性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)以小囊泡的形

3、式存在。 3.運(yùn)用瓊脂糖平板法研究了Gal-13對(duì)雛雞外周血淋巴細(xì)胞是否具有趨化功能，結(jié)果顯示Gal-13及Gal-13與巴氏桿菌作用后的混合物均能夠趨化淋巴細(xì)胞。 4.體外培養(yǎng)雛雞外周血淋巴細(xì)胞，運(yùn)用MTT法研究不同濃度Gal-13對(duì)淋巴細(xì)胞增殖功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：低劑量的Gal-13(0.625～1.250μg/ml)促進(jìn)LPS或ConA刺激的雛雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖(P＜0.01)，并與劑量呈正相關(guān)。但高劑量的G

4、al-13(5μg～10μg/ml)抑制外周血淋巴細(xì)胞的增殖(P＜0.01)。通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究了Gal-13對(duì)雛雞免疫系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雛雞飲水添加Gal-13(1μg/ml)后，與對(duì)照組比較，Gal-13提高了4日齡雛雞法氏囊指數(shù)(P＜0.10)、4～10日齡雛雞血清IgG及10～17日齡雛雞的血清IgM含量(P＜0.05)。Gal-13促進(jìn)17日齡雛雞的法氏囊淋巴細(xì)胞增殖(P＜0.01)以及7日齡雛雞的胸腺淋巴細(xì)胞

5、增殖(P＜0.01)，但是抑制了脾臟淋巴細(xì)胞增殖，且在10日齡差異顯著(P＜0.01)。Gal-13明顯提高了IBDV疫苗免疫后21天血清中抗體水平(P＜0.05)，但對(duì)雛雞腸道黏膜免疫無明顯影響(P＞0.05)，Gal-13組4～10日齡雛雞十二指腸、空腸的IEL細(xì)胞的數(shù)量低于對(duì)照組，且在4日齡明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。且Gal-13在一定程度上降低SP、VIP的表達(dá)。 5、體外培養(yǎng)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞，運(yùn)用細(xì)胞組織化學(xué)

6、染色，ELISA和流式細(xì)胞法探討了Gal-13的作用途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Gal-13可促進(jìn)單個(gè)核細(xì)胞NF-κB的活化、IL-12及IFN-α的分泌，促進(jìn)共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖，這些效應(yīng)可被TLR4阻斷劑阻斷。另外Gal-13還可減少外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4的數(shù)目。 由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：雛雞受到有害刺激后，可快速分泌抗菌肽Gal-13并通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞的趨化作用參與機(jī)體的抗感染免疫反應(yīng)；