間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)調(diào)控枯否細(xì)胞M1型和M2型改善肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝硬化是由各種因素引起慢性肝臟損害并發(fā)展至晚期階段的一類(lèi)疾病，其發(fā)病率和死亡率均呈逐年增高的趨勢(shì)，在全世界范圍內(nèi)，每年由肝硬化導(dǎo)致的死亡人數(shù)多達(dá)103萬(wàn)，肝硬化已在最常見(jiàn)的死亡病因中位列第14位[1]，嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康。目前采用內(nèi)科常規(guī)的保肝和對(duì)癥治療難以獲得良好療效，其有效手段仍然是原位肝移植，但是由于供肝缺乏、花費(fèi)巨大等因素極大地限制了肝移植的臨床應(yīng)用。因此，明確肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，在早期進(jìn)行預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化至關(guān)重要。

2、　　近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）被發(fā)現(xiàn)不僅具有自我更新、多向分化等潛能，其免疫調(diào)節(jié)作用也越來(lái)越受到臨床各個(gè)領(lǐng)域研究者的重視。研究發(fā)現(xiàn) MSCs可免疫調(diào)節(jié)慢性肝纖維化的炎癥，能夠明顯改善肝功，延長(zhǎng)終末期肝病患者的生存期，這為肝臟組織損傷修復(fù)和細(xì)胞治療帶來(lái)了切入點(diǎn)和新希望。
　　肝臟中有一類(lèi)重要的非實(shí)質(zhì)免疫細(xì)胞，即枯否細(xì)胞（Kupffer cells，KCs），它是機(jī)體內(nèi)一道重要防線(xiàn)，

3、在維持肝臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?，F(xiàn)有研究報(bào)道枯否細(xì)胞有兩種不同的激活途徑，分別產(chǎn)生兩種不同類(lèi)型的 KCs，即 M1型和M2型。這兩型細(xì)胞之間的平衡與腫瘤、感染及組織損傷等炎癥性疾病密切相關(guān)。
　　本課題組前期對(duì)MSCs調(diào)節(jié)KCs的研究進(jìn)行了探索。研究發(fā)現(xiàn)：將含有磷酸二鈉脂質(zhì)體的溶液經(jīng)尾靜脈注射給肝纖維化小鼠（CCl4肝損傷模型），用于剔除 KCs后，給予小鼠MSCs治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未剔除KCs組的肝纖維化小鼠治療效果明顯優(yōu)于

4、剔除KCs的治療組。進(jìn)一步研究表明，未剔除KCs組的小鼠肝內(nèi)M2型KCs相關(guān)因子CD206、Arg-1、IL-10的mRNA表達(dá)明顯升高，而M1型相關(guān)的CD68、TNF-α的mRNA表達(dá)降低。提示，肝臟KCs參與了MSCs治療肝纖維化的過(guò)程，可能通過(guò)誘導(dǎo) M2型肝臟KCs的激活來(lái)減輕肝纖維化。
　　本研究是在前期探索性研究的基礎(chǔ)上，仍采用經(jīng)典的CCl4腹腔注射法誘導(dǎo)肝纖維化小鼠模型，并對(duì)肝纖維化小鼠進(jìn)行同源MSCs移植治療，評(píng)價(jià)M

5、SCs移植后的治療效果，并主要探討MSCs通過(guò)促進(jìn)KCs類(lèi)型轉(zhuǎn)換治療肝纖維化的機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用MSCs治療肝纖維化提供新的理論研究依據(jù)。
　　【目的】
　　1.明確CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷不同階段KCs亞群M1/M2的比例變化；
　　2.闡明MSCs是否通過(guò)調(diào)控KCs亞群M1/M2的比率而參與肝損傷修復(fù)。
　　【方法】
　　1.利用CCl4腹腔注射8周以誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型。在肝纖維化造模的第2、4、6、8

6、w分別收集小鼠血清、采取小鼠肝臟，前者用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT及白蛋白ALB的水平；后者首先利用H&E染色方法觀(guān)察模型小鼠的肝臟炎癥，以及采用天狼星紅染色方法量化分析肝纖維化程度，然后將肝臟組織連續(xù)切片，分別單標(biāo)CD68和CD206進(jìn)行免疫組化染色，觀(guān)察兩型KCs在肝損傷不同時(shí)間段的變化；
　　2.采用原位膠原酶灌注法分離小鼠肝損傷不同時(shí)間段(2、4、6、8w)的肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)備皮、開(kāi)腹、插管后進(jìn)行原

7、位灌注，離心后得到肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，再將CD68和CD206作為雙標(biāo)進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)M1和M2在肝損傷不同時(shí)間段的百分比；
　　3.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)MSCs，在倒置顯微鏡和浮雕顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)以及當(dāng)MSCs生長(zhǎng)至第三代時(shí)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定；
　　4.將CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠隨機(jī)分為三組，分別是橄欖油對(duì)照組、未治療組和治療組。將同品系小鼠 MSCs經(jīng)尾靜脈移植給治療組（1x10

8、6cells/mice）。同樣通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)小鼠肝功能水平（AST、ALT、ALB），H&E和天狼星紅染色檢測(cè)肝組織炎癥和纖維化程度；采用膠原酶灌注法分離小鼠肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)雙標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)MSCs治療后的兩型KCs的百分比水平；
　　5.采用Real-time PCR方法測(cè)肝損傷以及MSCs治療后，不同時(shí)間段內(nèi)肝臟M1型（TNF-α、MCP1、IFN-γ）和M2型（Arg1、CD163、IL-10）相關(guān)因子表達(dá)水平。
　　【

9、結(jié)果】
　　1.腹腔注射CCl4第8w時(shí)，H&E染色和天狼星紅染色觀(guān)察到小鼠肝臟組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、形成顯著的纖維化。血生化檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)氨酶水平增高而白蛋白水平顯著降低，提示小鼠肝纖維化模型建立成功。
　　2.免疫組織化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷過(guò)程中，CD68標(biāo)記的M1型KCs逐漸升高，在第8w時(shí)表達(dá)明顯增強(qiáng)，達(dá)到高峰。CD206標(biāo)記的M2型KCs從第4w后逐漸升高，在第6w達(dá)到高峰

10、，而后逐漸降低。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，肝臟組織中M1型相關(guān)因子（TNF-α、MCP1、IFN-γ）從第2w逐漸增高，到第8w時(shí)表達(dá)最高，而 M2型相關(guān)因子（Arg1、CD163、IL-10）從第4w逐漸升高，在第6w達(dá)到高峰，隨后逐漸降低。提示：在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的不同階段中，M1和M2型KCs的比例發(fā)生了變化。
　　3.對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠給予同源MSCs移植后，MSCs移植組的治療效果明顯優(yōu)于其

11、他組，主要表現(xiàn)在小鼠肝組織損傷程度改善（可見(jiàn)H&E染色和天狼星紅染色），以及血清轉(zhuǎn)氨酶水平降低而白蛋白水平增高（可見(jiàn)血生化檢測(cè)）。
　　4.對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠進(jìn)行MSCs移植后，免疫組織化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，MSCs移植組中CD68標(biāo)記的M1型KCs表達(dá)降低，CD206標(biāo)記的M2型KCs表達(dá)增高。同時(shí)，Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，肝臟KCs的M1型相關(guān)因子（TNF-α、IFN-γ）表達(dá)水平降低，而M2

12、型相關(guān)因子（CD163、IL-10）表達(dá)水平增高。提示：MSCs可能通過(guò)促進(jìn)枯否細(xì)胞M1型向M2轉(zhuǎn)換而參與肝損傷修復(fù)。
　　【結(jié)論】
　　本研究發(fā)現(xiàn)：(1) KCs參與了CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠的病理?yè)p傷過(guò)程，在炎癥早期的KCs可能以M1型促炎為主，炎癥中晚期以M2型抗炎為主。當(dāng)M1/M2型細(xì)胞比率失衡，可能導(dǎo)致炎癥加重，造成肝損傷后恢復(fù)不良；(2)在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠病理?yè)p傷過(guò)程中，MSCs可能通過(guò)誘導(dǎo)KCs的M1