氨基甾體Z1對(duì)MEG-01白血病細(xì)胞的作用及其機(jī)理研究.pdf

1、目的:觀察氨基甾體Z1對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病MEG-01細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用,并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。
　　 方法:采用液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞的抑制增殖作用;采用Wright染色、醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-D NAE)染色、細(xì)胞膜CD41表面標(biāo)記物檢測(cè)觀察氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用;為進(jìn)一步了解氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞的作用機(jī)制,采用熒光分光光度計(jì)

2、檢測(cè)MEG-01細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的變化,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MEG-01細(xì)胞內(nèi)鈣通道蛋白mRNA及bcr/abl融合基因mRNA的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.氨基甾體Z1對(duì)正常人外周血細(xì)胞和MEG-01細(xì)胞增殖的影響。連續(xù)培養(yǎng)1～5d,不同濃度的氨基甾體Z1(10-8～10-4mol/L)能抑制MEG-01細(xì)胞的增殖。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,10-6mol/L氨基甾體Z1作用于正常人

3、外周血單個(gè)核細(xì)胞3d后,其MTT值為0.035±0.003,于對(duì)照組比較無顯著差異。10-8mol/L氨基甾體Z1作用5d后,MEG-01細(xì)胞的生長抑制率(GIR)為(50.87±11.67)％,藥物濃度增高,GIR增大。集落形成實(shí)驗(yàn)顯示氨基甾體Z1對(duì)正常外周血細(xì)胞無明顯作用,但能抑制MEG-01細(xì)胞的增殖且呈濃度依賴。
　　 2.氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞分化的影響。氨基甾體Z1作用于MEG-01細(xì)胞第5d后Wright染

4、色,與對(duì)照組比較,細(xì)胞核漿比例變小,細(xì)胞核不規(guī)則,核質(zhì)變粗,胞漿增多,淺染,核周胞質(zhì)出現(xiàn)淡染區(qū)。AS-D NAE染色后,處理組吸光值A(chǔ)較對(duì)照組明顯升高。流式細(xì)胞儀分析,10-6mol/L的氨基甾體Z1作用5d后,MEG-01細(xì)胞膜上CD41表面標(biāo)記表達(dá)陽性率為76％。
　　 3.氨基甾體Z1抑制MEG-01細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其分化的機(jī)制研究
　　 (1)氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]I的影響用Fura-2/AM

5、負(fù)載MEG-01細(xì)胞,10-6mol/L的氨基甾體Z1處理1h后,熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其A值為(131.70±2.16),與對(duì)照組A值(166.58±2.47)比較顯著降低。
　　 (2)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)氨基甾體Z1作用后MEG-01細(xì)胞TRPV6鈣通道蛋白mRNA表達(dá)量的變化終濃度為10-6mol/L的氨基甾體Z1作用于MEG-01細(xì)胞第5d,提取其RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增,實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行相對(duì)定量,其鈣通道蛋白基因

6、相對(duì)含量為(2.36±0.18)×10-3,與對(duì)照組(6.65±0.40)×10-3比較,TRPV6鈣通道蛋白mRNA表達(dá)下調(diào)。
　　 (3)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)氨基甾體Z1作用后MEG-01細(xì)胞bcr/abl融合基因mRNA表達(dá)量的變化終濃度為10-6mol/L的氨基甾體Z1作用于MEG-01細(xì)胞第5d,提取其RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增,實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行相對(duì)定量,其bcr/abl融合基因相對(duì)含量為(2.22±0.18)×

7、10-2,與對(duì)照組(6.21±0.22)×10-2比較,bcr/abl融合基因mRNA表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1.氨基甾體Z1能顯著抑制MEG-01細(xì)胞增殖,并呈一定的濃度依賴關(guān)系。但其對(duì)正常人外周血細(xì)胞無明顯抑制作用。
　　 2.氨基甾體Z1能誘導(dǎo)MEG-01細(xì)胞向巨核細(xì)胞系分化。
　　 3.氨基甾體Z1作用于MEG-01細(xì)胞1h,可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度下降,這可能與其阻斷了鈣通道有關(guān)。