單純皰疹病毒Ⅱ型人源性抗gD蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建.pdf

1、生殖器皰疹(GH)是一種由Ⅱ型單純皰疹病毒(HSV-2)引起的、日益增多的傳染力極強(qiáng)的病毒性、性傳播性疾病。具有潛在致癌性，易引起胎兒早產(chǎn)、死胎并且為HIV感染的危險(xiǎn)因素，極易傳播及復(fù)發(fā)，目前尚無特效藥物治療。生殖器皰疹的傳統(tǒng)治療包括一般性治療、抗病毒治療以及中醫(yī)藥治療。但需要指出的是，抗皰疹病毒藥物治療僅能減輕HSV感染者的癥狀和改善其體征，減少排毒，但治療還不能徹底清除病毒。一般性的治療和傳統(tǒng)的中醫(yī)藥事實(shí)上也只是對(duì)癥治療。在防治HS

2、V-2感染的手段中，疫苗是免疫治療的有效手段之一。傳統(tǒng)的疫苗雖然廣泛應(yīng)用于臨床，但是也存在許多缺點(diǎn)。目前研制的減毒疫苗，基因工程疫苗及DNA疫苗治療疾病都是一個(gè)主動(dòng)免疫的過程，對(duì)于目前日益增多的免疫缺陷和免疫功能低下的患者來說，疫苗就不能充分發(fā)揮其治療的優(yōu)勢(shì)作用。 近年來隨著人們生活方式的改變，免疫缺陷患者(如AIDS)及醫(yī)源性免疫功能低下的患者逐漸增多，傳統(tǒng)的抗病毒藥物治療及疫苗的主動(dòng)免疫治療尚不能滿足此類HSV感染的發(fā)病趨勢(shì)

3、。作為被動(dòng)免疫的抗體治療是GH治療有力的補(bǔ)充，用基因工程方法將抗體重鏈變變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段連接肽(Linker)連接而成的重組人源性單鏈抗體在GH治療中的應(yīng)用將為其治療開辟一條新途徑。 包膜糖蛋白是HSV感染發(fā)病的關(guān)鍵所在，在HSV-2編碼的糖蛋白中g(shù)D蛋白是病毒囊膜的主要成分，在病毒復(fù)制和刺激中和抗體的產(chǎn)生中起重要作用，是HSV主要的免疫原，能誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫，產(chǎn)生高滴度中和抗體，激發(fā)DTH反應(yīng)及T細(xì)胞

4、增殖反應(yīng)，gD免疫作用最強(qiáng)，因此，選擇HSV感染發(fā)病的關(guān)鍵分子gD蛋白作為目的抗原。 本課題利用20名HSV-2病毒IgG、IgM檢測(cè)為抗體陽性的生殖器皰疹患者外周血，共80Ml，分離淋巴細(xì)胞后提取完整的RNA，以O(shè)ligo(dT)20為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RT-PCR。參照美國(guó)Scripps研究所人源抗體庫構(gòu)建的引物，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出全套VH和VL基因片斷，分別擴(kuò)增出約360bp的重鏈可變區(qū)(VH)及320bp的輕鏈可變區(qū)(VL)

5、。經(jīng)純化回收的VH和VL片斷在接近等摩爾濃度下，由Linker片斷用重疊延伸拼接法組裝成單鏈抗體基因(scFv)，得到約為760bp的單鏈抗體片斷(scFv)。scFv經(jīng)sfiⅠ和NotⅠ雙酶切之后與經(jīng)過同樣雙酶切的噬粒載體pFAB5c連接，將重組噬粒電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliXL1-blue。將轉(zhuǎn)化克隆用M13K07輔助噬菌體援助后收集噬菌體上清，即為特異性單鏈抗體噬菌體抗體庫，得到的抗體庫其庫容為1.86×106，滴度為1.7