凋亡抑制基因survivin特異性shRNA誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：Survivin基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，它是凋亡抑制蛋白因子(inhibitor 9f apoptosis proteins，IAPs)家族的成員之一。Surivin是迄今已鑒定的8個(gè)IAPs家族成員(XIAP，HIAP-1，HIAP-2，NAIP,ILP-2，ML-IAP/Livin，apollon，survivin)中分子量(16.5 kD)最小和最具有基礎(chǔ)與臨床意義的基因，因而成為當(dāng)前腫瘤領(lǐng)域中最為矚目的一個(gè)研究熱點(diǎn)

2、之一。Survivin的過(guò)量表達(dá)可以幫助腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，實(shí)現(xiàn)異常增殖。抑制凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和參與細(xì)胞周期調(diào)控這三種重要的功能密切相關(guān)，共同作用于細(xì)胞，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。大多數(shù)研究表明survivin只表達(dá)于腫瘤組織，而在正常組織中不表達(dá)，雖有少數(shù)學(xué)者認(rèn)為survivin也可表達(dá)于正常組織，但這些研究也表明其在正常組織的表達(dá)強(qiáng)度顯著低于其在腫瘤組織的表達(dá)強(qiáng)度，這一獨(dú)特的特性，使survivin當(dāng)仁不讓

3、的成為新的腫瘤研究和治療的靶點(diǎn)。RNA干擾是用與目的基因mRNA相同序列的21-23 nt雙鏈小分子干擾RNA來(lái)特異性高效率的抑制目的基因蛋白的表達(dá)。有研究表明，帶有shRNA(小發(fā)夾RNA)表達(dá)框架的載體可以取得較高的RNA干擾效應(yīng)，已有不少學(xué)者應(yīng)用survivin特異的shRNA或siRNA對(duì)多種腫瘤進(jìn)行了干預(yù)治療，取得了顯著的效果，但對(duì)喉腫瘤的治療國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)的目的： 1.對(duì)60例喉鱗癌病理切片和10

4、例正常喉部粘膜進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，觀察survivin在喉鱗癌組織和正常喉部粘膜的表達(dá)情況； 2.構(gòu)建表達(dá)shRNA質(zhì)粒載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(喉癌細(xì)胞株)進(jìn)行體外RNA干擾實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)喉癌細(xì)胞中survivin基因的抑制效果，以及抑制喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。 方法： 1.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)survivin基因在60例喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本、10例正常喉粘膜中的表達(dá)。 2.選取了 surviv

5、in基因(NM_001168)序列中的三個(gè)位點(diǎn)序列作為siRNA 的正義鏈，正義鏈和反義鏈之間加入 9 個(gè)寡核苷酸(TTCAAGACG)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以TTTTTT作為終止信號(hào)，5’-端為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)末端，3’-端為HindⅢ酶切位點(diǎn)末端，合成寡核苷酸序列克隆到載體上，構(gòu)建三個(gè)靶向survivin的質(zhì)粒載體分別命名為survivin-shRNA-1， survivin-shRNA-2， survivin-shRNA-3，通過(guò)序列

6、測(cè)定鑒定重組子的正確性。 3.將三個(gè)重組survivin-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)在mRNA水平survivin-shRNA質(zhì)粒對(duì)survivin基因的沉默效果；運(yùn)用Western Blot檢測(cè)在蛋白水平survivin-shRNA質(zhì)粒對(duì)survivin基因的沉默效果；連續(xù)觀察五天喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，構(gòu)建生長(zhǎng)曲線(xiàn)，觀察對(duì)喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；應(yīng)用PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，觀

7、察干擾質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞周期的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞儀通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞的早期凋亡，PI單染檢測(cè)細(xì)胞的晚期凋亡，觀察干擾質(zhì)粒對(duì)喉鱗癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。 結(jié)果： 1.Survivin蛋白在10例正常喉粘膜中均無(wú)表達(dá)，60例喉鱗癌標(biāo)本中有41例陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為68.33％：其中男性56例，陽(yáng)性例數(shù)為40例，陽(yáng)性表達(dá)率為71.4 3％，女性4例，陽(yáng)性例數(shù)為1例，陽(yáng)性表達(dá)率為25％：60歲以上者32例，陽(yáng)

8、性例數(shù)為22例，陽(yáng)性表達(dá)率為68.75％，60歲以下者(包括60歲)28例，陽(yáng)性例數(shù)為19例，陽(yáng)性表達(dá)率為67.86％；聲門(mén)上型18例，陽(yáng)性例數(shù)為13例，陽(yáng)性表達(dá)率為72.22％，聲門(mén)型42例中28例陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為66.67％；按照國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)TNM分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)(1992)第四版第二次修訂的方案，臨床分期：Ⅰ-Ⅱ期31例，陽(yáng)性例數(shù)為17例，陽(yáng)性表達(dá)率54.84％，Ⅲ-Ⅳ期29例，陽(yáng)性例數(shù)24例，陽(yáng)性表達(dá)率82.76％：病理分

9、級(jí)：高分化鱗狀細(xì)胞癌28例，陽(yáng)性例數(shù)為20例，陽(yáng)性表達(dá)率為71.43％，中分化鱗狀細(xì)胞癌19例，陽(yáng)性例數(shù)為12例，陽(yáng)性表達(dá)率為63.16％，低分化鱗狀細(xì)胞癌13例，陽(yáng)性例數(shù)為9例，陽(yáng)性表達(dá)率為69.23％：病理證實(shí)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，陽(yáng)性例數(shù)為14例，陽(yáng)性表達(dá)率為93.33％，無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，陽(yáng)性例數(shù)為27例，陽(yáng)性表達(dá)率為60％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，喉癌組survivin蛋白的表達(dá)率明顯高于正常對(duì)照組(p<0.001)，survivi

10、n蛋白表達(dá)與喉鱗癌患者臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有顯著性(P<0.05)，頸淋巴結(jié)陽(yáng)性者survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于頸淋巴結(jié)陰性者；Ⅲ-Ⅳ期的患者survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ-Ⅱ期的患者：survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)在不同性別組的差異無(wú)顯著性(P=0.056)；survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)在不同年齡組的差異無(wú)顯著性(P=0.941)；survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)在不同發(fā)生部位的差異無(wú)顯著性(P=0.674)；sur

11、vivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)在不同病理分級(jí)組的差異無(wú)顯著性(P=0.836)。 2.酶切鑒定和DNA序列測(cè)定結(jié)果證實(shí)三個(gè)重組質(zhì)粒載體survivin-shRNA構(gòu)建正確，插入序列位置正確。 3.重組質(zhì)粒survivin-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后， RT-PCR結(jié)果顯示三個(gè)survivin-shRNA質(zhì)粒均使survivin基因在mRNA水平受到了顯著的抑制，分別下降了65.7 7±0.82％，56.66±0.70％，63.26±1

12、.0％，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組相比具有顯著性差異，三者之間相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3無(wú)顯著性差異，survivin-shRN A-2抑制率低于前兩者，而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組的mRNA量與未處理組相仿，無(wú)明顯下調(diào)；Western-blot結(jié)果顯示三個(gè)survivin-shRNA質(zhì)粒均使survivin基因在蛋白水平受到了顯著的抑制，分別下降了61.5 0±0.79％，52.91±1.43％，59.3

13、6±0.53％，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組相比具有顯著性差異，三者之間相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3無(wú)顯著性差異， survivin-shRNA-2抑制率低于前兩者，而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組的蛋白表達(dá)量與未處理組相仿，無(wú)明顯下調(diào)；生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果顯示三個(gè)survivin-shRN A質(zhì)粒均使喉癌細(xì)胞株生長(zhǎng)受到顯著抑制，在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)抑制效果達(dá)到最高，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組相比具有顯著性差異，三者之間相比，sur

14、vivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3抑制率相仿，且自72小時(shí)后survivin-shRN A-2組的細(xì)胞數(shù)與其他兩組有顯著性差異，說(shuō)明survivin-shRNA-2的抑制效果較survivin-shRNA-1，3為弱。PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒細(xì)胞組出現(xiàn)明顯G2/M期的阻滯，并且出現(xiàn)明顯的亞G1峰，標(biāo)示細(xì)胞晚期凋亡，凋亡百分率分別為15.32±1.969％，8.58±0.949％，14.

15、85±1.786％，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組相比具有顯著性差異，三者之間相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3無(wú)顯著性差異，survivin-shRN A-2凋亡率低于前兩者，而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組未出現(xiàn)G2/M期的阻滯現(xiàn)象，并且凋亡率(3.22±1.06％)與未處理組(1.36±0.243％)無(wú)明顯差別；Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡，顯示凋亡率分別為13.63±1.940％，8.61

16、±1.400％， 12.71±2.141％，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組相比具有顯著性差異，三者之間相比survivin-shRNA-1和survivin-shRNA-3無(wú)顯著性差異， survivin-shRNA-2凋亡率低于前兩者，而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組的早期凋亡率為2.58±0.632％，與未處理組相比(早期凋亡率為2.43±0.663％)無(wú)明顯差別。 結(jié)論及意義：重組survivin-shRNA質(zhì)?？梢韵抡{(diào)喉癌細(xì)胞株中surviv