Mfn-2對(duì)rVSMCs細(xì)胞周期的調(diào)控作用.pdf

1、本文主要從以下三個(gè)方面展開(kāi)論述：
　　第一部分 Mfn-1和Mfn-2在rVSMCs細(xì)胞周期中的表達(dá)差異
　　研究目的：研究線(xiàn)粒體融合素基因-2與線(xiàn)粒體融合素基因-1在大鼠血管平滑肌細(xì)胞周期中的表達(dá)差異,旨在闡明對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞周期具有調(diào)控作用的線(xiàn)粒體融合素基因。
　　方法：采用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24小時(shí)，無(wú)血清培養(yǎng)基同步化48小時(shí)后換用含10％血清的培養(yǎng)基再生長(zhǎng)18小時(shí)，胸腺嘧啶核苷和諾考達(dá)唑先后作用12小時(shí)誘導(dǎo)

2、大鼠血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期不同階段，分為兩組，其中一組PI染色后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，另一組提取細(xì)胞總蛋白后進(jìn)行Western Blot分析線(xiàn)粒體融合素基因-2、線(xiàn)粒體融合素基因-1和細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制劑p27、p21、pRb的表達(dá)。
　　結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24小時(shí)后，平均80.10％的大鼠血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期；無(wú)血清培養(yǎng)基同步化48小時(shí)后換用含10％血清的培養(yǎng)基再生長(zhǎng)18小時(shí)后，平均61

3、.27％的大鼠血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)入S期；胸腺嘧啶核苷和諾考達(dá)唑先后作用12小時(shí)后，平均75.06％的大鼠血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)入G2/M期;處于正常生長(zhǎng)周期中的大鼠血管平滑肌細(xì)胞G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞分布平均為51.36％,39.52％,9.12％，作為對(duì)照。Western Blot分析表明，G0/G1期線(xiàn)粒體融合素基因-2和細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制劑p27、p21的表達(dá)與對(duì)照組和G2/M期相比明顯升高（P＜0.05），pRb的表達(dá)

4、降低；而線(xiàn)粒體融合素基因-1G0/G1期的表達(dá)與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：在大鼠血管平滑肌細(xì)胞G0/G1期線(xiàn)粒體融合素基因-2的表達(dá)明顯增高，而線(xiàn)粒體融合素基因-1的表達(dá)并無(wú)明顯變化，表明線(xiàn)粒體融合素基因-2對(duì)大鼠血管平滑肌的細(xì)胞周期具有調(diào)控作用。
　　第二部分 rVSMCs細(xì)胞周期不同階段形態(tài)與代謝的變化
　　研究目的：研究大鼠血管平滑肌細(xì)胞周期不同階段細(xì)胞器的形態(tài)改變和代謝變化。
　　方法：將大鼠血

5、管平滑肌細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期的不同階段，采用激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)MitoTracker Red染色的線(xiàn)粒體形態(tài)的變化；通過(guò)透射電子顯微鏡顯示線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)的改變、線(xiàn)粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)毗鄰關(guān)系的變化以及自噬溶酶體的形成和積累過(guò)程；JC-1處理后運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的變化；采用化學(xué)法葡萄糖檢測(cè)試劑盒、氨基酸檢測(cè)試劑盒、ATP比色測(cè)定試劑盒、NAD＋/NADH定量檢測(cè)試劑盒和NADP＋/NADPH定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄糖代謝、氨基酸代謝、

6、ATP代謝、NAD＋/NADH和NADP＋/NADPH的變化。
　　結(jié)果：激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，G0/G1期線(xiàn)粒體呈管網(wǎng)狀分布，而對(duì)照組以及S期線(xiàn)粒體呈散在的粒狀分布，G2/M期線(xiàn)粒體呈散在的團(tuán)狀分布；進(jìn)一步通過(guò)透射電子顯微鏡顯示G0/G1期線(xiàn)粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的毗鄰關(guān)系更近，而且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甚至被拉向線(xiàn)粒體；S期線(xiàn)粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離，而且線(xiàn)粒體腫脹、嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池?cái)U(kuò)張；G2/M期線(xiàn)粒體數(shù)量減少，出現(xiàn)大量的自噬溶酶體。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表

7、明，從G0/G1期至G2/M期線(xiàn)粒體膜電位明顯下降（P＜0.05）。采用化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，葡萄糖代謝、氨基酸代謝、ATP代謝和NADP＋/NADPH在整個(gè)細(xì)胞周期中并未明顯變化，NAD＋含量在G0/G1期明顯降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論：盡管在大鼠血管平滑肌細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞周期中，葡萄糖、氨基酸和ATP代謝無(wú)顯著改變，但是在大鼠血管平滑肌細(xì)胞G0/G1期，當(dāng)線(xiàn)粒體融合素基因-2表達(dá)升高時(shí)，線(xiàn)粒體密集呈管網(wǎng)狀分布，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被拉向線(xiàn)粒

8、體，NAD＋含量明顯降低；而在大鼠血管平滑肌細(xì)胞G2/M期，當(dāng)線(xiàn)粒體融合素基因-2含量降低時(shí)，線(xiàn)粒體膜電位急劇下降，伴隨大量的自噬溶酶體形成。
　　第三部分 Mfn-2對(duì)rVSMCs線(xiàn)粒體重塑的影響
　　目的：研究過(guò)表達(dá)線(xiàn)粒體融合素基因-2對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞線(xiàn)粒體形態(tài)變化的影響。
　　方法：構(gòu)建Mfn-2的腺病毒載體Adv-Mfn-2-S442A，采用Adv-Mfn-2-S442A的不同感染復(fù)數(shù)25pfu/細(xì)胞和50

9、pfu/細(xì)胞感染血管平滑肌細(xì)胞24小時(shí)后，激光共聚集顯微鏡觀察MitoTracker Red染色后線(xiàn)粒體形態(tài)的變化。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建Mfn-2的腺病毒載體Adv-Mfn-2-S442A；Adv-Mfn-2-S442A以感染復(fù)數(shù)25pfu/細(xì)胞感染血管平滑肌細(xì)胞24小時(shí)后，激光共聚集顯微鏡顯示MitoTracker Red染色的線(xiàn)粒體在細(xì)胞漿內(nèi)呈散在團(tuán)狀分布；Adv-Mfn-2-S442A以不同感染復(fù)數(shù)50pfu/細(xì)胞感染血管平