肝臟祖細(xì)胞-卵圓細(xì)胞在肝硬化及肝癌中的增殖、與肝臟微環(huán)境關(guān)系及部分生物學(xué)特性研究.pdf

1、第一部分：一、目的：證實(shí)肝硬化組織中存在人肝臟祖細(xì)胞(HPCs)，探討HPCs分布及激活的強(qiáng)度與肝臟炎癥程度的關(guān)系,提供HPCs向肝細(xì)胞分化的依據(jù)。
　　 方法：對30例肝硬化及3例正常組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)觀察，對門脈炎癥程度進(jìn)行評分，并用膽管上皮標(biāo)志CK7和肝星狀細(xì)胞激活標(biāo)志SMA進(jìn)行免疫組化染色，對符合HPCs、中間型肝細(xì)胞以及小管樣反應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和半定量評分。
　　 結(jié)果：在正常肝組織中無門脈周圍HPCs和小

2、管樣反應(yīng)增殖。在肝硬化組織中，增殖的HPCs起源于肝門脈區(qū)域，隨著門脈炎癥程度加重，HPCs及小管樣反應(yīng)從肝硬化結(jié)節(jié)周圍向肝實(shí)質(zhì)擴(kuò)散并出現(xiàn)中間型肝細(xì)胞增殖，其周圍有顯著的肝星狀細(xì)胞激活。HPCs及小管樣反應(yīng)增殖程度隨著門脈炎癥程度的加重而增加。HPCs數(shù)目與中間型肝細(xì)胞數(shù)目之間存在正直線相關(guān)。ALT和AST與HPCs及中間型肝細(xì)胞數(shù)目存在正直線相關(guān)。
　　 結(jié)論：在人肝硬化中存在祖細(xì)胞的激活，炎癥反應(yīng)是HPCs激活的觸發(fā)因素，H

3、PCs向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)遷移并向肝細(xì)胞方向分化是肝再生的重要途徑。
　　 第一部分：二、目的：研究不同肝臟祖細(xì)胞標(biāo)志物在人肝硬化組織中的定位和分布，明確肝臟祖細(xì)胞群的免疫表型特征。
　　 方法：用OV-6，CK7，CK19，Hepatocyte，c-kit以及AFP對30例肝硬化及3例正常肝組織進(jìn)行免疫組化染色和激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)，觀察這些標(biāo)志物在不同細(xì)胞群中的分布。
　　 結(jié)果：正常肝臟中，膽管和膽小管上皮CK7及

4、CK19陽性，OV-6及c-kit陰性。在肝硬化中，門脈周圍區(qū)域的肝臟祖細(xì)胞(HPCs)及小管樣反應(yīng)細(xì)胞主要為OV-6(+)/ CK19(+)/CK7(+)/ Hepatocyte(+)，少數(shù)為OV-6(-)。隨著門脈及實(shí)質(zhì)內(nèi)炎癥的加重，HPCs及小管樣反應(yīng)從肝硬化結(jié)節(jié)周圍向肝實(shí)質(zhì)擴(kuò)散并出現(xiàn)中間型肝細(xì)胞增殖。HPCs及小管樣反應(yīng)細(xì)胞主要為OV-6(-)/CK19(+)/CK7(+),Hepatocyte(-)或(+)；中間型肝細(xì)胞為OV

5、-6(-)/CK19(-)/CK7(+)/ Hepatocyte(+),少數(shù)Hepatocyte(-)。門脈周圍區(qū)域和纖維間隔內(nèi)存在少量的c-kit(+)細(xì)胞，個(gè)別陽性細(xì)胞整合到成熟膽管，其余c-kit(+)細(xì)胞不共表達(dá)OV-6、CK7及CK19。
　　 結(jié)論：人肝硬化存在肝臟祖細(xì)胞的激活；肝臟祖細(xì)胞群的免疫表型差異表明祖細(xì)胞處于不同的分化增殖階段；不同肝臟祖細(xì)胞標(biāo)志物的聯(lián)合運(yùn)用是鑒別和研究肝臟祖細(xì)胞的有力工具。
　　

6、第一部分：三、目的：研究肝臟祖細(xì)胞標(biāo)志物c-kit、CK7在肝細(xì)胞肝癌(HCC)組織中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系。
　　 方法：對40例肝細(xì)胞肝癌標(biāo)本及3例正常組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)觀察以及c-kit、CK7、CD45免疫組化染色，對腫瘤細(xì)胞的分化程度進(jìn)行分型，分析c-kit、CK7表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌的臨床病理特征的聯(lián)系。
　　 結(jié)果：正常肝臟中c-kit染色陰性。19/40例HCC組織中存在c-kit(+)腫瘤細(xì)胞，在腫

7、瘤細(xì)胞之間或腫瘤結(jié)節(jié)周圍分散分布。30例(75[％])存在CK7陽性癌細(xì)胞，陽性程度強(qiáng)弱不一，主要存在兩種不同免疫反應(yīng)形態(tài)特征。HBsAg及Anti-HBc在c-kit(+)及CK7(+)HCC表達(dá)更常見(p<0.05)，c-kit、CK7表達(dá)與腫瘤的分化程度緊密相關(guān)(p<0.05)。
　　 結(jié)論：骨髓來源的肝臟祖細(xì)胞參與了HCC的形成和發(fā)展，c-kit、CK7對于判斷HCC預(yù)后有一定意義。
　　 第二部分：目的：闡明在

8、卵圓細(xì)胞介導(dǎo)的肝再生中肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、胞外基質(zhì)成分與卵圓細(xì)胞的相互作用，分析肝臟微環(huán)境對卵圓細(xì)胞的調(diào)控作用。
　　 方法：采用免疫組化及免疫熒光雙標(biāo)的方法動態(tài)觀察在2-AAF/PH大鼠卵圓細(xì)胞增殖模型中，隨著卵圓細(xì)胞的增殖和分化，Kupffer細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、肝臟胞外基質(zhì)成分(層粘連蛋白和纖維連接蛋白)的定位及與卵圓細(xì)胞的相互關(guān)系。
　　 結(jié)果：PH后第2天，小卵圓細(xì)胞開始向門靜脈周圍區(qū)域增殖。Desmin(+)的HS

9、Cs及l(fā)aminin主要出現(xiàn)在門靜脈周圍的肝竇狀隙內(nèi)，而Kupffer細(xì)胞和fibronectin在整個(gè)肝小葉內(nèi)表達(dá)顯著增加。從術(shù)后第4到第9天，卵圓細(xì)胞進(jìn)一步向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)增殖，與HSCs、laminin及fibronectin關(guān)系密切，Kupffer細(xì)胞與卵圓細(xì)胞混合在一起增殖，第6天以后開始減少。從術(shù)后第12到第15天，隨著卵圓細(xì)胞分化為小肝細(xì)胞節(jié)結(jié)，大多數(shù)HSCs、laminin及fibronectin位于節(jié)結(jié)周邊，少數(shù)出現(xiàn)在節(jié)結(jié)內(nèi)

10、，Kupffer細(xì)胞主要出現(xiàn)在中央靜脈周圍區(qū)域。第18天以后，正常的肝小葉結(jié)構(gòu)開始恢復(fù)。
　　 結(jié)論：在肝損傷后的重建修復(fù)過程中，卵圓細(xì)胞與肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、胞外基質(zhì)成分存在緊密的聯(lián)系，局部肝臟微環(huán)境可能通過細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用在卵圓細(xì)胞介導(dǎo)的肝再生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　 第三部分：目的：建立大鼠卵圓細(xì)胞增殖模型，探討其分離、鑒定、培養(yǎng)的方法；檢測卵圓細(xì)胞端粒酶活性及相關(guān)基因表達(dá)，探討與其增殖分

11、化之間的關(guān)系。
　　 方法：采用2-AAF/PH模型誘導(dǎo)大鼠卵圓細(xì)胞增殖，2-AAF劑量為15mg/kg，于術(shù)后9-12天采用改良的膠原酶灌注消化密度梯度離心法分離卵圓細(xì)胞，用電鏡、RT-PCR、細(xì)胞免疫熒光鑒定卵圓細(xì)胞，采用免疫組化、RT-PCR及端粒酶活性檢測試劑盒檢測分離的卵圓細(xì)胞及卵圓細(xì)胞系LE6端粒酶的表達(dá)，并分析其意義。
　　 結(jié)果：采用2-AAF/PH模型成功誘導(dǎo)大鼠卵圓細(xì)胞增殖。分離的卵圓細(xì)胞核大，卵圓形

12、，胞漿少，呈鋪路石樣生長，細(xì)胞直徑約7～12μm，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)有少量絨毛樣突起，核漿比例大，胞漿內(nèi)細(xì)胞器少且發(fā)育不成熟。細(xì)胞免疫熒光、RT-PCR結(jié)果顯示表達(dá)0V-6、AFP、CK19、Albumin、C-KIT、CK18、Thy-1。免疫組織化學(xué)顯示端粒酶催化亞單位TERT表達(dá)在門靜脈周圍增殖的卵圓細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)，隨著卵圓細(xì)胞逐漸向肝細(xì)胞方向分化，TERT陽性細(xì)胞數(shù)目顯著較少。分離的卵圓細(xì)胞及卵圓細(xì)胞系均表達(dá)端粒酶亞單位TERT及TR，