海島棉H276A雄性不育的細(xì)胞學(xué)與分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility,CMS)是植物雜種優(yōu)勢(shì)的利用的基礎(chǔ)，并且已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于水稻、玉米等作物中。棉花（Gossypium barbadense L.）是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也具有顯著的雜種優(yōu)勢(shì)。但是由于其CMS資源的匱乏，導(dǎo)致雜種優(yōu)勢(shì)的利用受到了極大的限制。因此，開(kāi)展棉花CMS不育分子機(jī)理研究，為更好的利用棉花雜種優(yōu)勢(shì)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。海島棉CMS系H276A是劉冬梅等利用花粉管通

2、道法通過(guò)轉(zhuǎn)紅麻HcPDIL5-2a基因創(chuàng)造的新型胞質(zhì)不育系。該不育系是由其保持系H276B突變而來(lái)，所以其為細(xì)胞質(zhì)近等基因系。在棉花CMS機(jī)理的研究中，可以排除由于線粒體基因組進(jìn)化所造成的非CMS相關(guān)冗余遺傳信息的干擾，為棉花CMS分子機(jī)理的研究提供了極有價(jià)值的研究材料。本研究從細(xì)胞學(xué)、線粒體基因組及轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)海島棉CMS系H276A的敗育機(jī)理進(jìn)行了探索，得到以下主要結(jié)論:
　　1.采用石蠟切片的方法對(duì)不育系和保持系的花藥發(fā)育過(guò)程

3、進(jìn)行了比較分析，確定了海島棉CMS系H276A花藥敗育開(kāi)始于四分體時(shí)期，其敗育特征主要是四分體細(xì)胞核液泡化，絨氈層在花藥發(fā)育過(guò)程中完整、不發(fā)生降解?；ㄋ幖?xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，四分體時(shí)期不育系絨氈層細(xì)胞部分線粒體出現(xiàn)內(nèi)膜降解現(xiàn)象。
　　2.利用EcoRⅠ和HindⅢ兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)不育系和保持系線粒體基因組進(jìn)行RFLP分析。結(jié)果表明，使用EcoRⅠ進(jìn)行單酶切時(shí)，atp1、nad4、nad7、nad9、ccmb在不育系和保持系之間呈

4、現(xiàn)多態(tài)性，使用HindⅢ進(jìn)行單酶切時(shí)，atp4、nad5、nad9、sdh4、cox3在不育系和保持系之間呈現(xiàn)多態(tài)性，其它基因則不表現(xiàn)多態(tài)性。以上結(jié)果表明，不育系H276A在線粒體基因atp1、atp4、nad4、nad5、nad7、nad9、sdh4、ccmb、cox3編碼區(qū)或者編碼區(qū)附近DNA水平上發(fā)生了突變，這些突變可能與棉花CMS的發(fā)生相關(guān)。
　　3.以35個(gè)棉花線粒體蛋白編碼基因?yàn)樘结槍?duì)不育系和保持系進(jìn)行RNA blot

5、分析，結(jié)果表明線粒體基因雖然不存在轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度多態(tài)性，但發(fā)現(xiàn)不育系中cox3基因轉(zhuǎn)錄本豐度顯著降低（約是保持系的0.3-0.4倍），對(duì)cox3進(jìn)一步進(jìn)行熒光定量分析，表明該基因在不育系中的相對(duì)表達(dá)量是保持系中的0.39倍。由此推測(cè)cox3的異常表達(dá)與棉花CMS形成過(guò)程中能量缺失有關(guān)。
　　4.利用RNA環(huán)化的方法對(duì)cox3基因的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在保持系中的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本為1515bp，其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)分別位于起

6、始密碼子(ATG)上游-412bp及下游1103bp處。在不育系H276A中cox3的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)與保持系相同，然而卻有三個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于起始密碼子上游-473、-466和-451處。對(duì)cox3基因上游序列進(jìn)行克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)，不育系中該基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近發(fā)生了7SNPs突變。由此推測(cè)這7SNPs引起cox3在不育系中的轉(zhuǎn)錄識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變從而導(dǎo)致該基因表達(dá)量顯著降低。
　　5.在ATP合成酶基因的相對(duì)表達(dá)量分析中，以保

7、持系為對(duì)照，結(jié)果表明除atp4(0.94)外，不育系中atp1(0.7)、atp6(0.64)、atp8(0.59)、atp9(0.61)的表達(dá)水平顯著降低。另一方面，在可育F1代中atp1(1.25)、atp4(2.06)、atp6(1.64)、atp8(1.55)和atp9(2.27)表達(dá)量顯著升高。表明了恢復(fù)基因的引入提高了ATP合成酶基因的表達(dá)，同時(shí)也進(jìn)一步確定了棉花CMS的發(fā)生與能量代謝缺失相關(guān)。
　　6.采用同源克隆的

8、方法對(duì)線粒體ATP合成酶5個(gè)基因進(jìn)行RNA編輯分析，共檢測(cè)到41個(gè)RNA編輯位點(diǎn)且都是C-T轉(zhuǎn)換，其中完全編輯位點(diǎn)27個(gè)，不完全編輯位點(diǎn)14個(gè)。對(duì)RNA編輯位點(diǎn)的氨基酸變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，RNA編輯引起蛋白質(zhì)多肽鏈中疏水氨基酸含量增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增強(qiáng)。另外，發(fā)現(xiàn)2個(gè)由RNA編輯產(chǎn)生的新的終止密碼子，一個(gè)位于atp6第787位點(diǎn)，另一個(gè)位于atp9第223位點(diǎn)，但是比對(duì)不育系、保持系及可育F1代中的RNA編輯頻率發(fā)現(xiàn)，ATP合成酶基因

9、RNA編輯與棉花CMS沒(méi)有直接的相關(guān)性。
　　7.基于不育系H276A線粒體蛋白編碼基因atp8基因上游6bp的缺失，開(kāi)發(fā)了一對(duì)可以鑒別棉花雄性可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)的分子標(biāo)簽。對(duì)41份已知育性的棉花種質(zhì)資源進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該分子標(biāo)簽穩(wěn)定、可靠，為棉花CMS胞質(zhì)資源的選育提供了一個(gè)有力的工具。
　　8.通過(guò)Illumina Hiseq4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)不育系和保持系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究中，共檢測(cè)到64，675個(gè)共同表達(dá)基因，篩選

10、出3603個(gè)差異表達(dá)基因(5.57％)其中1363上調(diào)表達(dá)，2240個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行進(jìn)一步生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)76個(gè)差異表達(dá)基因參與了TCA循環(huán)、氧化磷酸化、糖酵解等與植物能量代謝相關(guān)途徑，且大部分基因顯著下調(diào)表達(dá)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一些編碼PPR蛋白、MYB轉(zhuǎn)錄因子及花藥特異表達(dá)的差異基因。隨機(jī)選取了15個(gè)可能與棉花CMS相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證，結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。對(duì)上述差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步深