部分銅綠假單胞菌臨床分離株中整合子的分布、耐藥性分析及其分子生物學(xué)特征.pdf

1、目的： 了解整合子在部分銅綠假單胞菌臨床分離株中的分布及耐藥性情況，分析整合子與銅綠假單胞菌耐藥和多重耐藥的相關(guān)性。 了解整合子可變區(qū)攜帶的耐藥基因型，研究其分子生物學(xué)特征，探討整合子在細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和傳播擴(kuò)散中的作用。 材料與方法： 1.菌株來源： 1997年至2003年問江蘇省人民醫(yī)院收集并隨機(jī)抽取的非重復(fù)性并具有臨床意義的銅綠假單胞茵菌株，共47株。 2.方法： 以煮沸法提取

2、47株銅綠假單胞菌的總DNA為模板，根據(jù)1、3類整合子各自整合酶基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物，PCR擴(kuò)增以篩選出各自陽性菌株；再將整合子陽性菌株與銅綠假單胞菌PU21共孵，行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)；采用瓊脂平皿稀釋法對47株菌株以及轉(zhuǎn)移接合子進(jìn)行MIC測定，分析藥敏情況。 對1類整合子陽性菌株，根據(jù)1類整合子5’和3’保守區(qū)設(shè)計(jì)的通用可變區(qū)引物，PCR擴(kuò)增其可變區(qū)。 將可變區(qū)PCR產(chǎn)物膠回收純化后，進(jìn)行序列分析，結(jié)果與Genbank序列進(jìn)

3、行比對，確定可變區(qū)所含耐藥基因盒。 以1類整合子陽性菌株與其對應(yīng)接合子的總DNA為模板，根據(jù)1類整合子可變區(qū)測序結(jié)果設(shè)計(jì)所含耐藥基因盒對應(yīng)的引物，PCR擴(kuò)增每一個耐藥基因以確認(rèn)克隆測序結(jié)果及初步檢驗(yàn)整合子是否處于質(zhì)粒上。 采用堿裂解法抽取整合子陽性菌株與其對應(yīng)接合子的質(zhì)粒。 采用脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析整合子陽性菌株的同源性。 結(jié)果：

4、 47株銅綠假單胞菌經(jīng)PCR法29株檢測到含有1類整合酶，占所有分離菌株的61.7％(29/47)，3類整合子未檢出。藥敏結(jié)果顯示1類整合子陽性菌株較陰性菌株耐藥率明顯升高；整合子陽性菌株對哌拉西林、頭孢他啶、阿米卡星、慶大霉素、氯霉素、鏈霉素的耐藥率最高，達(dá)到100％。29株1類整合子陽性菌株均轉(zhuǎn)移接合成功；轉(zhuǎn)移接合子與野生株比較，對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、環(huán)丙沙星均敏感，MIC90分別下降了8、128和128倍。

5、 29株攜帶的1類整合子可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物均約為4.3kb。 序列分析結(jié)果表明：發(fā)現(xiàn)該可變區(qū)包含4個耐藥基因盒，形成一個新的組合形式aac(6’)-Ⅱ-aadA13-cmlA8-oxa-10，已提交Genbank，序列號為EU182575。其中aadA13首次在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)。同時(shí)第三個開放閱讀框的序列未見報(bào)道，與已知的cm1A5同源性最高為95％，將其命名為cm1A8。 無論野生株或接合子經(jīng)PCR均分別擴(kuò)增出上述4個

6、耐藥基因盒，序列測定與克隆測序一致。 無論野生株或接合子均抽提出大小一致，大于10Kb的耐藥性質(zhì)粒。 脈沖場凝膠電泳的分析結(jié)果顯示，所有1類整合子陽性菌株具有高度同源性，存在克隆傳播和可能相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論： 本院銅綠假單胞菌臨床分離株中有1類整合子的流行。1類整合子陽性的菌株較陰性菌株對多種抗生素更容易產(chǎn)生耐藥。結(jié)合藥敏表型及整合子攜帶耐藥基因的基因型，整合子與銅綠假單胞茵耐藥和多重耐藥相關(guān)。和野生株相比