P162抑制Hedgehog信號轉錄因子Gli-1增強食管癌Eca109細胞的放射敏感性.pdf

1、目的:探討靶向G3BP(RasGAP結合蛋白)新藥多肽P162是否通過抑制Hedgehog信號轉錄因子Gli-1對人食管癌細胞株Eca109起放射增敏作用
　　方法:1.多次反復以8Gy劑量X線(總共累計60 Gy)照射食管癌Eca109細胞誘導Eca109R細胞;
　　2.采用CCK8法測Eca109及Eca109R細胞在0、2、4、6、8Gy下增殖抑制率,比較兩者之間的差異;
　　3.免疫細胞化學法、免疫熒光技術測

2、Gli-1在Eca109及Eca109R細胞內表達;
　　4. HE染色觀察20μmol/L P162作用48小時后Eca109及Eca109R細胞形態(tài)學改變;
　　5. Western blot測照射后Eca109細胞在1、2、4、24、48、72 h、7、10、14、18d時間點核內Gli-1表達,以未照射Eca109細胞為對照;Western blot測照射后Eca109R細胞在48h時間點核內Gli-1表達,以未照射

3、Eca109R細胞為對照;
　　6. Western blot測處理組細胞核內Gli-1表達:處理組給予兩種干預方法,先20μmol/L P162干預48 h,后6 Gy照射,分為四組,即:未照射不加藥組、未照射加藥組、照射加藥組和照射不加藥組,每組均含Eca109、Eca109R兩種細胞。
　　7.流式細胞儀測處理組細胞凋亡率。
　　結果:1.在相同的照射劑量及相同時間下, Eca109R細胞增殖抑制率明顯低于Eca

4、109細胞;
　　2.免疫細胞化學、免疫熒光技術結果顯示Eca109、Eca109 R細胞中胞核、胞漿均表達蛋白 Gli-1,兩者免疫組織化學染色強度分別為:1.05629±0.098,1.703975±0.055(P<0.05),免疫熒光陽性細胞率分別為:39.9567±0.0097％,66.4589±0.0251%(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義,提示Eca109較Eca109R細胞低表達核內蛋白Gli-1;
　　3.

5、 HE染色結果:未處理的Eca109細胞呈圓形或不規(guī)則多邊形,如鋪路石排列,Eca109R細胞呈不規(guī)則梭型,不規(guī)則排列。經(jīng)20μmol/L P162處理48 h后的Eca109細胞皺縮聚集,變?yōu)椴灰?guī)則條形,可見細胞裂解相互融合,Eca109R細胞亦表現(xiàn)為皺縮聚集,可見核縮小、多核,細胞裂解融合。
　　4. Western blot測放療后Eca109細胞在1、2、4、24、48、72 h、7、10、14 d、18d時間點核內Gli

6、-1表達,結果顯示:照射后核蛋白Gli-1逐漸下調,與control(未照射Eca109細胞)相比,第48h表達最低(P<0.05),此后逐漸上調,第14d表達最高(P<0.05),18 d趨于下降趨勢;與照射前相比,Eca109R細胞照射后48 h核內蛋白Gli-1下調。
　　5. Western blot測照射及P162處理后Eca109、Eca109R細胞核內Gli-1表達變化:未照射加藥組較未照射不加藥組低表達 Gli-1

7、,其中未照射不加藥組中, Eca109R較Eca109高表達Gli-1(F=135.73, P<0.0001);照射加藥組較照射不加藥組(照射后2、14 d)低表達Gli-1,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中照射不加藥組(照射后2、14 d)中, Eca109與Eca109R的Gli-1表達無統(tǒng)計學差異[分別為F=1.89, P=0.2064(2 d), F=0.45,P=0.5191(14 d)].
　　結論:Hh信號轉