預測的鸚鵡熱嗜衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白的定位及相關性質(zhì)的初步研究.pdf

1、目的：鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci， Cps）是一種嚴格細胞內(nèi)寄生，多宿主性的人獸共患病病原體，臨床上仍缺乏有效的防治藥物。尋找Cps和宿主細胞相互作用的關鍵效應蛋白，以作為研制防治性藥物的靶點是目前衣原體研究的“熱點”課題?，F(xiàn)有資料表明Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system，T3SS）效應蛋白是Cps與宿主細胞相互作用的關鍵。本研究對預測、篩選的Cps T3SS效應蛋白的定位和

2、表達進行了初步的分析，并進一步對其體外誘導人單核細胞（THP-1）分泌IL-6、IL-1β、TNF-α前炎癥因子（CKs）的水平進行了檢測。方法：將預測的Cps T3SS效應蛋白編碼基因，經(jīng)原核表達、純化后獲得融合蛋白，用融合蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，并以多克隆抗體為一抗，采用間接免疫熒光技術檢測預測蛋白在感染細胞的定位情況。分別在Cps感染Hela細胞后8h，18h，24h，36h，48h提取蛋白，用制備的一抗通過Wes

3、tern Blot（WB）來觀察蛋白表達時相。將多粘菌素 B處理過的GST-CPSIT_0271蛋白體外刺激THP-1細胞，并于6h、12h、24h、36h、48h收集細胞，采用ELISA檢測IL-6、TNF-α和IL-1β水平。
　　結果：
　　1.構建的10個預測 Cps T3SS效應蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒：CPSIT_0139， CPSIT_0271， CPSIT_0363， CPSIT_0499， CPSIT_070

4、0， CPSIT_0788， CPSIT_0803，CPSIT_0959，CPSIT_0965，CPSIT_0991，經(jīng)測序鑒定證實插入片段為目的基因，測序結果與Genbank上登錄序列經(jīng)BLAST比對完全一致；經(jīng)誘導表達獲得6個可溶性表達蛋白，分別是：CPSIT_0139，CPSIT_0271， CPSIT_0363，CPSIT_0700，CPSIT_0788，CPSIT_0959；間接ELISA法測定免疫小鼠血清特異性抗體的效價：C

5、PSIT_0363與CPSIT_0959為1:64000， CPSIT_0700與CPSIT_0788為1:32000，CPSIT_0271與CPSIT_0139為1:16000；
　　2.間接免疫熒光法顯示預測蛋白的分布與Cps包涵體的分布位置大致相同；
　　3. WB結果顯示 CPSIT_0139， CPSIT_0271， CPSIT_0363， CPSIT_0700， CPSIT_0788，CPSIT_0959分別在感

6、染后24h，36h，18h，24h，36h，18h才出現(xiàn)明顯的蛋白表達；
　　4.一定濃度的GST-CPSIT_0271蛋白能顯著誘導THP-1細胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α和IL-1β，當GST-CPSIT_0271蛋白濃度為2μg/mL~5μg/mL時，CKs的水平與蛋白呈明顯的劑量依賴關系；用5μg/mL的GST-CPSIT_0271蛋白刺激THP-1細胞24h時，TNF-α和IL-1β量達到高峰，隨后它們的水平逐漸下降，48

7、h時IL-6量達到高峰。
　　結論：
　　1. CPSIT_0139， CPSIT_0271， CPSIT_0363， CPSIT_0700， CPSIT_0788， CPSIT_0959重組蛋白具有良好的免疫原性，能刺激小鼠產(chǎn)生較高效價的抗體；CPSIT_0139，CPSIT_0271，CPSIT_0363，CPSIT_0700，CPSIT_0788， CPSIT_095可能分布在包涵體內(nèi)或包涵體膜上；
　　2. C