根癌農桿菌介導的中國石竹遺傳轉化體系的建立及幾丁質酶基因的導入.pdf

1、中國石竹(Dianthuschinensis)原產中國，是園林綠化中較好的地被材料，但在栽培過程中發(fā)現在潮濕溫暖環(huán)境下，易染石竹葉斑病。幾丁質酶是植物受病原菌侵染后誘導產生的，雖然植物本身未發(fā)現幾丁質，但很多植物病原菌細胞壁的主要成分是幾丁質，幾丁質酶可抑制一些病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長。目前在植物抗病基因工程中，幾丁質酶基因的應用效果顯著，多種轉幾丁質酶基因植物的抗病性明顯高于對照。本試驗試圖采用基因工程的方法，初步建立中國石竹的遺傳轉

2、化體系，并將玉米幾丁質酶基因導入石竹，以獲得抗病的石竹品種。實驗結果如下： 1.建立起以葉片為外植體的高頻再生體系取頂芽下第二三對葉片，以遠軸面和培養(yǎng)基接觸的方式在MS1(MS+0.1mg/LBA+1.0mg/L2,4-D)中預培養(yǎng)3d后，轉入MS2(MS+1.0mg/LBA+0.3mg/LNAA)中分化培養(yǎng)，獲得了68.3﹪的再生頻率。 2.建立了以葉片為受體的遺傳轉化體系用pBI121/LBA4404對影響石竹轉化效

3、率的因素進行比較試驗，確定的轉化條件為：切取轉化受體材料在MS1中預培養(yǎng)3～4d。將二次活化至OD600=0.5的菌液離心，重懸于相同體積添加100μmol/L乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中，將預培養(yǎng)葉片放入其中，侵染6～8min，滅菌濾紙吸干，放入添加100μmol/L乙酰丁香酮的水中共培養(yǎng)(濾紙為基質)，暗培養(yǎng)3～4d。共培養(yǎng)結束后，將葉片在附加500mg/LCef的1/2MS液體培養(yǎng)基中輕輕振蕩洗滌10min，滅菌濾紙吸干，轉入MS

4、2+50mg/LKm+400mg/LCef中進行篩選分化培養(yǎng)，出芽后轉入MS6(MS+0.5mg/LBA+0.3mg/LNAA+50mg/LKm+200mg/LCef)中進行增殖篩選。再生芽轉入生根篩選培養(yǎng)基MS7(1/2MS+25mg/LKm)中進行生根篩選。 3.兒丁質酶基因的導入及轉基因植株的鑒定在建立起的石竹轉化體系上，將幾丁質酶基因導入石竹，葉片平均再生率為6.9﹪，共獲得25株生根的抗性植株。PCR檢測顯示，其中5株