鵝肥肝形成過(guò)程中差異表達(dá)miRNA篩選及miRNA-33的表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約21-23nt的非編碼RNA分子，其對(duì)基因的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮重要作用。已有研究表明miRNA在人和小鼠肝臟脂肪代謝障礙中起著重要調(diào)控作用。鵝肝臟沉積脂肪能力很強(qiáng)但不會(huì)有明顯的病理癥狀，是研究肝臟脂類代謝很好的模型。本研究采用第二代高通量測(cè)序方法，檢測(cè)鵝肥肝形成中差異表達(dá)的miRNA，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，同時(shí)結(jié)合前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究結(jié)果，構(gòu)建miRNA與基因間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出可能起

2、核心作用的miRNA和靶基因。然后從篩選結(jié)果中挑選部分重要miRNA和對(duì)應(yīng)靶基因(miRNA-33和CROT基因)，利用鵝原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、Western Blot等技術(shù)進(jìn)行靶向關(guān)系驗(yàn)證及調(diào)控機(jī)制研究，為進(jìn)一步闡明鵝肥肝形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.朗德鵝填飼效果及小RNA測(cè)序質(zhì)量:70日齡的朗德鵝在經(jīng)過(guò)19天的填飼后，較對(duì)照組其體重和肝重均發(fā)生顯著的增長(zhǎng)(P＜0.05)。其中，

3、填飼組和對(duì)照組鵝體重分別為7.57±0.48 kg以及3.87±0.25 kg(n=6)，肝重分別為826.26±182.26 g和80.63±12.80 g，肝體比（肝重/體重）分別為10.86％和2.08％。同時(shí)，填飼組鵝肝臟的顏色也由正常的深紅色變?yōu)橹靖蔚湫偷狞S褐色，表明填飼后實(shí)驗(yàn)鵝確實(shí)產(chǎn)生了明顯的脂肪肝。對(duì)送測(cè)樣本的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)表明，RNA的樣品濃度≥80ng/μL，RNA無(wú)降解，無(wú)污染，總體質(zhì)量較高。
　　2.鵝

4、肥肝形成過(guò)程中差異miRNA分析及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:通過(guò)對(duì)鵝不同填飼階段(7天、14天和19天)填飼組和對(duì)照組的肝臟進(jìn)行小RNA測(cè)序，并對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、拼接和注釋，最終獲得了1163個(gè)有注釋信息的miRNA。在77日齡、84日齡、89日齡三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較填飼組和對(duì)照組不同階段肝臟miRNA表達(dá)的差異，結(jié)果在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別篩選出30（17個(gè)填飼組上調(diào)）、48（36個(gè)填飼組上調(diào)）和151（114個(gè)填飼組上調(diào)）個(gè)差異表達(dá)的miRNA。結(jié)合前期轉(zhuǎn)

5、錄組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，在77日齡、84日齡、89日齡三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別獲得234個(gè)、445個(gè)、845個(gè)預(yù)測(cè)靶基因，其中在填飼組上調(diào)的預(yù)測(cè)靶基因分別為156個(gè)、270個(gè)、211個(gè)。對(duì)獲得的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，起關(guān)鍵調(diào)控作用的顯著富集通路包括:碳水化合物、脂質(zhì)和氨基酸代謝通路，細(xì)胞生長(zhǎng)死亡通路，免疫系統(tǒng)通路等。以差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶基因的互作

6、關(guān)系并構(gòu)建miRNA與基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　3.miRNA-33及其靶基因CROT的表達(dá)調(diào)控研究:本課題組在前期的工作中發(fā)現(xiàn)miRNA-33與脂肪代謝緊密相關(guān)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)其靶基因進(jìn)行了初步的預(yù)測(cè)和研究，發(fā)現(xiàn)CROT基因?yàn)槠淇赡艿陌谢颉１狙芯拷Y(jié)果也發(fā)現(xiàn)，miRNA-33在填飼的不同階段（尤其是填飼后期）均發(fā)生了表達(dá)量的上調(diào)。因此，本試驗(yàn)對(duì)miRNA-33及其靶基因CROT的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　熒光定量PCR

7、結(jié)果與小RNA測(cè)序結(jié)果相符，證實(shí)了miRNA-33在填飼各階段肝臟中均顯著上調(diào)。此外，miRNA-33在腹脂和胸肌中其表達(dá)水平也受填飼的影響而顯著升高，表明miRNA確實(shí)與填飼引起的脂肪代謝變化相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-33的預(yù)測(cè)靶基因CROT基因在填飼各階段肝臟中的mRNA水平均顯著下調(diào)，且在19天填飼組中的蛋白表達(dá)水平也顯著下調(diào)，這與miRNA-33的表達(dá)趨勢(shì)正好相反，表明在鵝肥肝形成過(guò)程中miRNA-33可能參與CROT基

8、因的表達(dá)調(diào)控。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在鵝原代肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-33 mimic和miRNA-33質(zhì)粒后，CROT基因的mRNA表達(dá)受到了顯著抑制;而在鵝原代肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-33 inhibitor之后，CROT基因的mRNA表達(dá)則顯著升高，表明CROT基因確實(shí)為miRNA-33的靶基因。使用脂肪肝形成相關(guān)因子（葡萄糖和胰島素）處理鵝原代肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，葡萄糖處理可以顯著抑制miRNA-33的表達(dá)并誘導(dǎo)CROT基因，而胰島素