細粒棘球絳蟲基因工程疫苗候選分子EgA31的原核表達及免疫學鑒定.pdf

1、背景與目的：包蟲病是由細粒棘球絳蟲的幼蟲引起的一種人畜共患病,在我國牧區(qū)廣泛流行,嚴重影響了牧區(qū)人民的健康并造成畜牧業(yè)的經(jīng)濟損失(1,2)。目前對該病的控制主要以犬的驅蟲和對牧民的預防教育為主,但在發(fā)展中國家效果較差(3,4)。疫苗預防將是控制該病的理想途徑。理論上,通過對中間宿主(羊、牛等家畜)或終末宿主采取有效的免疫保護均能切斷細粒棘球絳蟲生活史的循環(huán)鏈,阻斷包蟲病的流行。用于中間宿主(羊)的疫苗研究方面已取得較理想的結果。Ligh

2、towlers等(12,13)報道了抗囊性包蟲病的重組疫苗 EG95,對羊的免疫保護率可達到96-100％,但由于牧區(qū)羊的數(shù)量巨大,牲畜疫苗免疫的實施費用較高,操作繁勞,難以被社會接受。
　　犬是細粒棘球絳蟲的終末宿主,控制了犬的感染就中斷了蟲卵的傳播,從而保護中間宿主(包括人)免受感染,且牧區(qū)犬的數(shù)量遠少于牛、羊等家畜,因此對終末宿主犬的免疫保護應是非常有效的途徑。Fu等(5,6)用感染犬血清在一細粒棘球絳蟲 cDNA表達文庫中

3、篩選出一66kDa cDNA克隆 EgA31,該cDNA克隆5′端表達多肽可引起顯著的宿主體液免疫和細胞免疫。為了獲得更好的抗原性及免疫原性,本研究通過原核表達系統(tǒng)獲得 EgA31 cDNA3′端表達多肽,對其抗原性和免疫原性進行分析、鑒定,為進一步將 EgA31用于診斷及疫苗的研究奠定基礎。
　　材料和方法：(1)通過 PCR方法擴增 EgA31cDNA,將得到的cDNA片斷用限制性內切酶酶切,然后亞克隆入 pGEX-5X-3表

4、達質粒,鑒定、篩選陽性質粒, DNA測序儀測序。
　　(2)將陽性重組質粒轉化 Escherichia coli BL21宿主菌, IPTG誘導重組質粒的表達,優(yōu)化表達條件。大量表達融合蛋白,GSTrapFF柱親和層析純化表達產物,SDS-PAGE鑒定表達產物的分子量及純化效果, Bradford法測定重組蛋白含量。(3)用純化的融合蛋白免疫豚鼠,獲得抗血清, ELISA法檢測豚鼠抗體水平, Western blot法進行分析鑒定

5、。
　　研究結果：(1) PCR擴增得到500bp cDNA片斷,亞克隆入pGEX載體,經(jīng)酶切和 PCR方法鑒定結果表明 pGEX/EgA31重組質粒成功構建。測序檢驗重組質粒中 EgA31cDNA序列無誤。開放讀碼框正確。
　　(2) SDS-PAGE結果顯示分離純化的 EgA31/GST融合蛋白分子量大小約為45kDa,GSTrapFF柱親和層析純化表達產物得到較高純度的融合蛋白,蛋白表達量可達到每升培養(yǎng)基15mg重組蛋

6、白。
　　(3) ELISA結果顯示 EgA31/GST融合蛋白可激起豚鼠體內較強的體液免疫反應, IgG水平明顯增高。免疫豚鼠得到的抗血清可與細粒棘球絳蟲原頭蚴總蛋白在66kDa處特異性反應。并與其它蟲體蛋白之間存在交叉反應。
　　結論：(1)成功構建 pGEX/EgA31重組質粒。
　　(2) EgA31/GST融合蛋白獲得高效表達,并成功純化,具備被進一步制備為工程菌的條件。
　　(3)融合蛋白可激起豚鼠較