雌激素調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞P2X7受體的機(jī)制研究.pdf

1、雌激素是體內(nèi)一類重要的類固醇激素，不但對(duì)女性乳腺、卵巢、子宮等生殖器官的發(fā)育有重要影響，而且在心血管、內(nèi)分泌激素及骨骼系統(tǒng)中發(fā)揮作用。乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一。研究表明，體內(nèi)雌激素水平增高可增加乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。絕經(jīng)期婦女中其乳腺癌患病率與體內(nèi)血液雌激素水平呈高度相關(guān)。雌激素在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及分子生物學(xué)機(jī)制是近年來研究的熱點(diǎn)，對(duì)防治乳腺癌及降低其復(fù)發(fā)率也有著重要的意義。
　　 雌激素發(fā)揮效應(yīng)主要是通過經(jīng)典的雌激素

2、核受體來完成。即通過激活細(xì)胞內(nèi)核受體，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，因此又被稱為激素的基因組作用(Genomic Actions)。ERα和ERβ屬于經(jīng)典的依賴配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。雌激素與其結(jié)合后，通過雌激素反應(yīng)元件(estrogen reactive elementERE)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)雌激素還可以與DNA上其他一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而募集其他共激活因子。ERα與ERβ因其結(jié)構(gòu)不同，在腫瘤增殖過程中發(fā)揮不同的作用。

3、r>　　 近來研究發(fā)現(xiàn)激素還有生長(zhǎng)因子樣的非核效應(yīng)，又被稱為激素的非基因組作用(Non-Genomic Action)。G蛋白偶聯(lián)受體-30(G protein-coupled receptor30,GPR30)是一種新型膜受體。研究證實(shí)它可與雌激素特異性地結(jié)合，快速激活細(xì)胞內(nèi)EGFR-MAPK，ERK，P13K-AKT等信號(hào)通路，參與乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等行為，并且與乳腺癌的耐藥性有關(guān)。
　　 胞外核苷酸受體稱為P2受

4、體，包括P2X和P2Y兩個(gè)家族。P2Y家族是具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白耦聯(lián)受體(含8個(gè)亞型)，P2X家族則屬配體門控非選擇性陽離子通道，是2次跨膜受體(含7個(gè)亞型)。P2X7受體廣泛存在于人體各種組織，并根據(jù)組織類型有不同分布，在乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌等腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的正常組織。P2X7受體可誘導(dǎo)表皮細(xì)胞分化，引起巨噬細(xì)胞融合，刺激細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放等，還可通過多條MAPK通路參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡。P2X7受體可

5、促進(jìn)一些腫瘤細(xì)胞的增殖分化。其可能的機(jī)制為：P2X7受體可以提高細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化效率，增加ATP儲(chǔ)量。此外，有研究發(fā)現(xiàn)正常甲狀腺組織內(nèi)P2受體激活可導(dǎo)致IL-6釋放，而在某些內(nèi)分泌組織中，IL-6有促細(xì)胞增殖與分化作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠的三叉神經(jīng)節(jié)中P2X3mRNA及蛋白水平均升高，而雌激素替代療法可降低P2X3基因與蛋白水平的表達(dá)。雌激素通過調(diào)節(jié)初級(jí)感覺神經(jīng)元中P2X3受體，參與外周痛覺轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這種作用

6、可能是通過基因組效應(yīng)完成的。在直結(jié)腸至炎大鼠的背根神經(jīng)節(jié)中，雌激素可上調(diào).P2X3mRNA表達(dá)。這些均提示雌激素對(duì)P2X受體有調(diào)控作用。我們之前做了大量的工作，可以初步證明在雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞中，雌激素可上調(diào)P2X7受體的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖。
　　 為進(jìn)一步闡明雌激素調(diào)控P2X7受體可能的受體機(jī)制及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，故本實(shí)驗(yàn)以雌激素受體ERα(+)、ERβ(+)、GPR30(+)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7為模型，觀察雌激素通

7、過何種受體調(diào)節(jié)P2X7受體的表達(dá)從而影響細(xì)胞的增殖活力，以及其中可能的分子生物學(xué)機(jī)制。為臨床工作中雌激素依賴性腫瘤(卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌)的治療提供新的思路與理論依據(jù)。
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料和方法：
　　 (一)細(xì)胞增殖率的測(cè)定
　　 采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率。接種于96孔板上的細(xì)胞經(jīng)過藥物處理，每孔加15μlMTT繼續(xù)培養(yǎng)3-4hr，吸去培養(yǎng)基，各孔加入150μlDMSO，置于搖床上低速震蕩5min。酶標(biāo)儀490

8、nm處波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度。
　　 (二)RNA提取和Real-timePCR
　　 1、細(xì)胞總RNA提取和cDNA合成
　　 接種于12孔板中(1×105個(gè)/孔)的細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，以Trizol提取液提取總RNA，采用紫外分光光度法測(cè)定RNA樣品純度(OD260/OD280)。同時(shí)進(jìn)行RNA定量測(cè)定。提取的RNA中，每樣本取2μg在25μl體系中反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存，用于實(shí)時(shí)定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)擴(kuò)增P2X7

9、受體基因。
　　 2、Real-timePCR
　　 用于擴(kuò)增P2X7受體的引物對(duì)為：Sense，AGATCGTGGAGAATGGAGTG；Antisense，TTCTCGTGGTGTAGTTGTGG。反應(yīng)條件95℃5min，95℃30sec，58℃25秒，72℃30秒，40個(gè)循環(huán)。
　　 用于擴(kuò)增β-actin的基因引物為Sense，GTGGGGCGCCCCAGGCACCA；Antisense，CTCCTTAA

10、TGTCACGCACGATTTC。反應(yīng)條件95℃5min，95℃30sec，55.5℃25秒，72℃30秒，40個(gè)循環(huán)。
　　 (三)Western Blot
　　 種于6孔板的細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，以預(yù)冷的RIPA緩沖液裂解標(biāo)本，提取樣本蛋白。分光光度儀測(cè)定蛋白含量，各孔上樣量50～80mg蛋白，經(jīng)10％濃度的SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜。封閉，洗滌后分別加1:200稀釋的兔抗人抗體P2X7(70

11、kD)，1:500稀釋的兔抗人抗體ERα(66kD)，1:500稀釋的鼠抗人抗體ERB(56kD)，1:1000稀釋的兔抗人抗體AKT(60kD)，1:1000稀釋的兔抗人抗體ERK1/2(44/42kD)，1:8000稀釋的鼠抗人抗體β-actin(42kD)，4℃過夜。洗滌后，分別加入1:1000稀釋耦聯(lián)辣根過氧化物酶的羊抗兔抗體和羊抗鼠抗體，室溫孵育2hr后采用加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。
　　 (四)siRNA(小干擾

12、RNA)：
　　 根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明，用熒光標(biāo)記的siRNA篩選最佳轉(zhuǎn)染條件和最佳目的siRNA。將含25nmol/LsiRNA及轉(zhuǎn)染試劑的無血清培養(yǎng)基混合均勻，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。分別于18hr、24hr更換新鮮無激素培養(yǎng)基。經(jīng)不同藥物處理細(xì)胞后，采用MTT和westernblot等方法測(cè)定細(xì)胞增殖率或目的蛋白表達(dá)情況。
　　 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 (一)雌激素通過ERα對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的促增殖作用
　　 1

13、、雌激素及其拮抗劑對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖活力的影響
　　 用17β-E2(0.1nmol/L-1μmol/L)處理MCF-7細(xì)胞48hr后，細(xì)胞的增殖活力均大于對(duì)照組的120％(各組P＜0.01)。ER拮抗劑ICI182，780可阻斷17β-E2對(duì)細(xì)胞的促增殖作用。
　　 2、ERα參與雌激素對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖活力的影響
　　 雌激素受體ERα選擇性激動(dòng)劑PPT(0.1nmol/L-10μmol/L)作用MCF-

14、7細(xì)胞48hr后，細(xì)胞的增殖活力均大于對(duì)照組的120％(各組P＜0.01)。ICI182，780可阻斷PPT對(duì)細(xì)胞的促增殖作用。共同以17β-E2和ERα拮抗劑MPP作用于細(xì)胞96hr后，MPP阻斷了17β-E2對(duì)細(xì)胞的促增殖作用。ERα表達(dá)降低也可阻斷17β-E2的促細(xì)胞增殖效應(yīng)。
　　 3、ERβ不參與雌激素對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖活力的影響
　　 ERβ拮抗劑PHTPP不能阻斷17β-E2對(duì)MCF-7細(xì)胞的促增殖效應(yīng)。

15、ERβ表達(dá)降低不能阻斷17β-E2對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖活力的促進(jìn)作用。
　　 4、GPR30對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖活力的影響
　　 MTT結(jié)果顯示，雌激素膜受體GPR30選擇性激動(dòng)劑G-1不同濃度(0.1nmol/L-1μmol/L)作用于MCF-7細(xì)胞48hr后，細(xì)胞增殖活力無明顯改變。
　　 (二)P2X7受體參與雌激素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的促增殖作用
　　 1、P2X7受體激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)雌激素促M(fèi)

16、CF-7細(xì)胞增殖的影響
　　 MTT結(jié)果顯示，不同濃度P2X7受體激動(dòng)劑BzATP(10μmol/L-1mmol/L)作用MCF-7細(xì)胞48hr后，細(xì)胞增殖活力均明顯增加。P2X7受體拮抗劑PPADS既能阻斷BzATP對(duì)細(xì)胞的促增殖效應(yīng)，也能阻斷17β-E2對(duì)細(xì)胞促增殖效應(yīng)。
　　 2、雌激素受體ERα對(duì)P2X7受體表達(dá)的影響
　　 Western blot結(jié)果顯示，不同濃度17β-E2(0.1nmol/L-0.

17、1μmol/L)作用MCF-7細(xì)胞24hr后，可上調(diào)P2X7受體的蛋白表達(dá)。
　　 實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示，單獨(dú)給予17β-E2(0.1μmol/L)處理MCF-7細(xì)胞后P2X7mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯增加(P＜0.01)；ERα拮抗劑MPP(50μmol/L)阻斷了17β-E2對(duì)P2X7mRNA及蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。
　　 單獨(dú)給予雌激素受體ERα選擇性激動(dòng)劑PPT(0.1μmol/L)

18、處理MCF-7細(xì)胞后48hr后P2X7蛋白表達(dá)量明顯增加(P＜0.05)；雌激素受體ER拮抗劑ICI182，780能夠阻斷PPT對(duì)P2X7蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。
　　 采用ERαsiRNA有效降低ERα表達(dá)后，給予17β-E2(0.1gμmol/L)作用于MCF-7細(xì)胞48hr，其P2X7蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比無明顯與改變(P＞0.05)。
　　 3、雌激素受體ERβ對(duì)P2X7受體表達(dá)的影響
　　 共同以17β-

19、E2(0.1μmol/L)和PHTPP作用細(xì)胞，P2X7mRNA及蛋白表達(dá)量較單獨(dú)給予17β-E2組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　 給予雌激素受體ERβ選擇性激動(dòng)劑DPN(1nmol/L-10μmol/L)作用細(xì)胞48hr，P2X7蛋白表達(dá)無明顯改變。提示雌激素受體ERβ選擇性激動(dòng)劑DPN不能上調(diào)MCF-7細(xì)胞中P2X7蛋白的表達(dá)。
　　 4、雌激素受體GPR30對(duì)P2X7受體表達(dá)的影響
　　 給予雌激素

20、受體GPR30選擇性激動(dòng)劑G-1(1μmol/L)與GRP30選擇性拮抗劑G-15(1μmol/L)單獨(dú)或聯(lián)合作用細(xì)胞4hr，P2X7受體蛋白表達(dá)無明顯改變，提示GPR30不影響P2X7受體蛋白表達(dá)。
　　 (三)雌激素對(duì)MCF-7細(xì)胞P2X7受體調(diào)節(jié)作用的機(jī)制研究
　　 1、雌激素及ERα對(duì)ERK1/2蛋白磷酸化的影響
　　 單獨(dú)給予17β-E2(0.1μmol/L)或ERα選擇性激動(dòng)劑PPT(0.1μmol/

21、L)處理MCF-7細(xì)胞15min和4hr，其p-ERK1/2蛋白表達(dá)量明顯升高，提示15min及4hr內(nèi)17β-E2或PPT均可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平。且ICI182，780可阻斷17β-E2或PPT對(duì)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平的上調(diào)作用。
　　 2、雌激素及ERα對(duì)Akt蛋白磷酸化的影響
　　 以同樣方法處理細(xì)胞，結(jié)果提示15min和4hr內(nèi)17β-E2或PPT均可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt的蛋白含量，且這一作

22、用可被ICl182，780阻斷。
　　 3、GPR30對(duì)ERK1/2及Akt蛋白磷酸化的影響
　　 GPR30選擇性激動(dòng)劑G-1(1μmol/L)作用細(xì)胞后15min，4hr后，對(duì)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2蛋白及Akt蛋白磷酸化有明顯促進(jìn)作用。
　　 4、雌激素通過ERK1/2通路或AKT通路對(duì)P2X7蛋白的影響
　　 以U0126或LY294002與雌激素共同作用細(xì)胞，與單獨(dú)給予17β-E2組相比，P2X7蛋白

23、表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。提示ERK1/2拮抗劑U0126或Akt拮抗劑LY294002可阻斷17β-E2對(duì)MCF-7細(xì)胞中P2X7的上調(diào)作用。
　　 三、結(jié)論
　　 1、雌激素通過激活ERα促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖活力。
　　 2、雌激素通過ERα上調(diào)MCF-7細(xì)胞P2X7受體表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖。
　　 3、雌激素可能通過ERK1/2及AKT途徑上調(diào)P2X7受體的表達(dá)。