細(xì)粒棘球絳蟲糞抗原的篩選及ELISA檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、棘球蚴?。ㄋ追Q包蟲?。┦怯杉?xì)粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus）的中絳期（幼蟲）——細(xì)粒棘球蚴寄生于動(dòng)物和人的肝、肺及其他器官而引起的一種呈世界性分布人獸共患病。棘球蚴病對(duì)人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展都產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害，它不僅是一個(gè)特殊的醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)問題，而且更是一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)問題。
　　蛋白質(zhì)組(proteome)是研究分析一個(gè)基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)，主要利用雙向凝膠電泳(Two-Dimensional El

2、ectrophoresis，2-DE)作為其技術(shù)支撐。這一概念最早是在1994年的一次學(xué)術(shù)會(huì)議上由Marc Wilkins提出的。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究某一生物、組織或細(xì)胞在特定條件下基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)特征的學(xué)科，其主要應(yīng)用高分辨率的分離技術(shù)、質(zhì)譜鑒定技術(shù)以及生物信息學(xué)技術(shù)。
　　本研究通過人工感染細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，收集感染后不同時(shí)間的犬糞樣品，進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和質(zhì)譜分析，采用蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、免疫學(xué)和

3、分子生物學(xué)技術(shù)篩選鑒定理想的診斷抗原，結(jié)果顯示，從糞上清液中共鑒定出蛋白質(zhì)3242個(gè)，其中宿主（犬）蛋白3107個(gè)，細(xì)粒棘球絳蟲蛋白135個(gè)。針對(duì)分析結(jié)果，選擇特異性蛋白EMR、GAPDH、TMEM41B進(jìn)行基因克隆，構(gòu)建pET30a重組表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)，用純化表達(dá)產(chǎn)物建立細(xì)粒棘球絳蟲感染犬糞抗原雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，以市售試劑盒檢測(cè)確定的20份自然感染細(xì)粒棘球絳蟲陽性犬糞上清為檢測(cè)樣品對(duì)篩選得到的蛋白進(jìn)行評(píng)估。以重組蛋

4、白pET30a-EMR免疫的動(dòng)物血清為包被一抗（捕獲抗體）時(shí)，檢出陽性率為35％;以重組蛋白pET30a-GAPDH免疫的動(dòng)物血清為包被一抗時(shí)，檢出陽性率為45％;以重組蛋白pET30a-TMEM41B免疫的動(dòng)物血清為包被一抗時(shí)，檢出陽性率為25％。對(duì)人工感染多房棘球絳蟲的犬糞樣品進(jìn)行檢測(cè)，以重組蛋白pET30a-EMR免疫血清包被時(shí)，多房棘球絳蟲的檢測(cè)呈陽性，多頭帶絳蟲、泡狀帶絳蟲檢測(cè)顯示為陰性;以重組蛋白pET30a-GAPDH免疫

5、血清包被時(shí)，多房棘球絳蟲、多頭帶絳蟲、泡狀帶絳蟲檢測(cè)顯示均為陽性;以重組蛋白pET30a-TMEM41B免疫血清包被時(shí)，多房棘球絳蟲、多頭帶絳蟲的檢測(cè)為陽性，泡狀帶絳蟲檢測(cè)顯示為陰性。
　　本研究旨在建立細(xì)粒棘球絳蟲糞抗原ELISA檢測(cè)方法，能夠及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)流行區(qū)終末宿主棘球絳蟲感染情況，從而為制定綜合防控措施，控制棘球蚴病的流行提供技術(shù)支撐。本研究的方法和結(jié)果為今后進(jìn)一步篩選和鑒定理想候選診斷抗原，研制犬細(xì)粒棘球絳蟲感染糞抗