埃他卡林對腦神經(jīng)血管單元的保護作用及其分子機制.pdf

1、腦血管疾病是威脅人類健康的重大疾病之一,具有高死亡率,高發(fā)病率和高并發(fā)癥發(fā)生率的特點。調(diào)查顯示全世界每年大約有795,000名的人群受到其危害,其相關(guān)治療費用更是高達68.9億美元。其中約70％為缺血性腦血管疾病。我國是腦血管疾病的高發(fā)國之一,并且近20年來其發(fā)病率一直呈上升趨勢,腦血管疾病已成為我國人口的第二大死亡原因。目前針對其臨床治療的藥物療效有限,亟需研發(fā)具有新作用靶點和作用途徑的缺血性腦血管疾病治療藥物。
　　缺氧腦損傷

2、的主要病理改變是腦缺氧導致神經(jīng)元死亡,從而影響腦功能,在此過程中神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞以及腦微血管內(nèi)皮細胞自身的損傷、壞死和凋亡以及相互的影響是腦組織損傷過程的細胞變化基礎(chǔ)。隨著近年來醫(yī)學界對中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種細胞形態(tài)和功能的再認識,神經(jīng)血管單元(neurovascular unit,NVU)概念逐步得到醫(yī)學界的認同。所謂NVU,是指由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞、小膠質(zhì)細胞及維持腦組織完整性的細胞外基質(zhì)和他們之間的相互作用和相互聯(lián)系

3、構(gòu)成的一個整體概念。NVU擴充了血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)的內(nèi)涵與外延,具有多種細胞組成的動態(tài)微環(huán)境結(jié)構(gòu)特征。NVU與缺血性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系,其作為一個功能模塊,已日益成為治療腦缺氧損傷研究的重要靶點之一。
　　ATP敏感性鉀離子通道(KATP通道)是細胞膜上可以偶聯(lián)細胞興奮性和能量代謝的受細胞內(nèi)ATP濃度調(diào)控的、具有弱內(nèi)向整流作用的一類重要分子。文獻報道,KATP通道在大腦各區(qū)幾

4、乎均有表達,在神經(jīng)血管單元的三種主要細胞神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞上也有分布表達。研究顯示,該通道在生理條件下往往處于關(guān)閉狀態(tài),而在缺血/缺氧狀態(tài)下開放,通過減少興奮性遞質(zhì)的釋放以及啟動下游多條細胞信號通路,可在多種組織中發(fā)揮抗缺血/缺氧損傷的內(nèi)源性保護作用。
　　埃他卡林是我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的一類新藥,具有脂肪胺結(jié)構(gòu)的新結(jié)構(gòu)類型的KATP通道開放劑,在國際上被列為第九類鉀通道開放劑。他是小分子化合物能夠透過血腦屏障。前期研究發(fā)

5、現(xiàn)在沙土鼠雙側(cè)頸動脈結(jié)扎全腦缺血模型上發(fā)現(xiàn)埃他卡林對缺血所致動物行為異常具有明顯的對抗作用,能夠減少興奮性遞質(zhì)的釋放;能夠劑量依賴性地減少全腦缺血所致海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的丟失。在腦卒中易感型自發(fā)性高血壓大鼠鹽負荷模型上發(fā)現(xiàn),埃他卡林劑量依賴性地減少腦卒中的發(fā)生率和致死率,延緩卒中發(fā)生并延長存活時間;在減壓缺氧大鼠腦損傷模型上發(fā)現(xiàn),埃他卡林對高原腦水腫具有防治作用,能夠維持血腦屏障的通透性,維持腦內(nèi)離子平衡。但是埃他卡林作為ATP敏感

6、性鉀通道開放劑在缺氧腦損傷的模型上是否可以靶向神經(jīng)血管單元發(fā)揮保護作用以及埃他卡林是如何針對缺氧腦損傷靶向于缺氧腦損傷進程中神經(jīng)血管單元的功能的動態(tài)變化及其相互調(diào)節(jié)來發(fā)揮作用的,即埃他卡林實現(xiàn)神經(jīng)血管保護作用的分子作用機制尚未闡明。進一步明確埃他卡林對缺氧性腦損傷的保護作用及其機制將為埃他卡林靶向神經(jīng)血管單元發(fā)展成為針對神經(jīng)損傷多元復雜病理機制諸多關(guān)鍵環(huán)節(jié)和高度激活的復雜信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應(yīng)的多潛能神經(jīng)保護劑提供進一步的實驗研究基礎(chǔ),也將為

7、缺氧腦損傷的預防和治療帶來新的治療策略。
　　本研究從不同的層次來研究埃他卡林對缺氧損傷神經(jīng)血管單元的多環(huán)節(jié)多途徑保護作用。在整體動物水平上,采用10%氧濃度常壓缺氧艙,并結(jié)扎大鼠單側(cè)頸總動脈造成缺氧腦損傷模型,證明埃他卡林對大鼠缺氧腦損傷的神經(jīng)保護作用。在細胞水平上,建立連二亞硫酸鈉無糖環(huán)境誘導細胞糖氧剝奪缺氧損傷模型,通過神經(jīng)血管單元(NVU)成員細胞神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和微血管內(nèi)皮細胞實驗,證實埃他卡林具有抗缺氧損傷NVU細

8、胞的保護作用。此外,本研究進一步探究埃他卡林激活KATP通道靶向神經(jīng)血管單元抗缺氧腦損傷涉及的分子機制。
　　研究得到了如下的結(jié)果:
　　第一部分：埃他卡林對腦神經(jīng)血管單元缺氧損傷的保護作用
　　一、埃他卡林對神經(jīng)血管單元主要細胞類型的保護作用
　　1、神經(jīng)血管單元細胞表達KATP亞型的差異
　　RT-PCR結(jié)果顯示,在NVU三種細胞中Kir6.1的mRNA表達不同,微血管內(nèi)皮細胞﹤神經(jīng)元﹤星形膠質(zhì)細胞;S

9、UR2B的mRNA表達也有差異,神經(jīng)元﹤星形膠質(zhì)細胞﹤微血管內(nèi)皮細胞;在微血管內(nèi)皮細胞中Kir6.1和Sur2B的表達比較也存在顯著差異,Kir6.1﹤SUR2B。
　　2、埃他卡林對神經(jīng)血管單元缺氧損傷細胞存活率的影響
　　在體外細胞缺氧損傷模型下,給予0.01,0.1,到1μmmol/l的埃他卡林可以明顯地提高NVU細胞包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞缺氧損傷后的存活率。
　　3、埃他卡林對神經(jīng)血管單元缺

10、氧損傷細胞LDH的釋放的影響
　　0.01,0.1,和1μmmol/l的埃他卡林后可以顯著的降低NVU成員細胞在低氧損傷下LDH的釋放量。埃他卡林的這種作用可以被KATP的阻斷劑格列苯脲所阻斷。
　　二、埃他卡林對大鼠缺血缺氧腦損傷的保護作用
　　1、埃他卡林對大鼠缺血缺氧腦損傷病理改變的影響
　　利用大鼠單側(cè)頸總動脈結(jié)扎并處于10%常壓缺氧環(huán)境造成,大鼠缺氧腦損傷模型,用HE染色的方法觀察大鼠腦組織的病理變化,

11、結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷組大鼠腦皮層神經(jīng)細胞間隙明顯增大,血管周圍間隙增大,神經(jīng)元數(shù)量減少,神經(jīng)膠質(zhì)細胞腫脹增大,毛細血管擴張充血。不同劑量的埃他卡林給藥組(2,4,8mg/kg,每天灌胃給予)仍可見少量的膠質(zhì)細胞和血管周圍空暈,隨著劑量增大,腦組織損傷程度逐漸減輕。
　　2、埃他卡林對大鼠缺血缺氧腦損傷血腦屏障通透性變化的影響
　　通過透射電鏡觀察大鼠缺血缺氧腦損傷后血腦屏障的結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn),正常情況下,可見血管外周間隙致密;缺血缺氧組

12、大鼠血管和組織外周間隙增大,可見明顯的間隙和空泡;不同劑量埃他卡林(2,4,8kg/mg,每天灌胃給予)組作用之后可見血管外周間歇有不同程度的減小。
　　第二部分：埃他卡林對腦神經(jīng)血管單元缺氧損傷保護作用分子機制的研究
　　一、埃他卡林對神經(jīng)血管單元缺氧損傷凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
　　1、埃他卡林對神經(jīng)血管單元缺氧損傷細胞凋亡形態(tài)學的影響
　　Hoechest33258染色發(fā)現(xiàn),神經(jīng)血管單元細胞在缺氧損傷的環(huán)境中

13、,體現(xiàn)細胞核染色質(zhì)密度增加,濃縮集聚等典型的凋亡特征,而給予埃他卡林后,凋亡細胞數(shù)量下降,染色質(zhì)濃縮程度減輕。
　　2、埃他卡林對神經(jīng)血管單元缺氧損傷細胞凋亡率的影響
　　流式細胞儀檢測神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞的凋亡率,在缺氧條件下,較之正常組,凋亡率顯著增高(P﹤0.05),三種細胞皆有類似的結(jié)果。給予0.01,0.1和1μmmol/l埃他卡林后,凋亡率顯著降低。
　　3、埃他卡林對缺氧損傷神經(jīng)血管單元細胞抗凋

14、亡作用強弱比較
　　埃他卡林對神經(jīng)元的抗凋亡作用與它對內(nèi)皮細胞的抗凋亡作用存在顯著差異,(P﹤0.025)。埃他卡林對抗缺氧損傷引起星形膠質(zhì)細胞的凋亡作用與它對內(nèi)皮的抗凋亡作用也明顯差異,(P﹤0.017)。
　　4、埃他卡林對神經(jīng)血管單元缺氧損傷細胞凋亡相關(guān)通路的影響
　　缺氧損傷之后,神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞以及內(nèi)皮細胞中caspase-3mRNA和蛋白在模型組較之正常組均明顯增高,0.01到1μmmol/l埃他卡林給

15、藥組中caspase-3mRNA和蛋白表達較之模型組都發(fā)生顯著下調(diào)。0.01到1μmmol/l的埃他卡林處理細胞之后,NVU三種成員細胞中bax的mRNA表達較之模型組顯著下降,而bcl-2的mRNA表達則明顯升高。模型組細胞中caspase-9的蛋白表達明顯升高,與正常組有顯著差異,P﹤0.05。而埃他卡林作用組中caspase-9的蛋白表達顯著下降。NVU細胞缺氧損傷后,Westernblot的方法檢查細胞胞漿中的cytC的蛋白表達

16、較之正常對照明顯增加,而1mmol/l的埃他卡林可以逆轉(zhuǎn)cytC的表達上調(diào)。此外,Westernblot的方法還證實星形膠質(zhì)細胞和微血管內(nèi)皮細胞中pAkt/tAkt的蛋白表達在缺氧損傷后顯著下調(diào),而埃他卡林可以明顯的上調(diào)pAkt/tAkt的蛋白表達。
　　5、埃他卡林調(diào)節(jié)大鼠缺氧腦損傷腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達情況
　　大鼠缺氧腦損傷后,利用IHC的方法發(fā)現(xiàn)腦組織中Bcl-2的表達減少,同時Bax的表達增加,致Bcl-2/Bax

17、的比值減小。當灌胃給予8mg/kg埃他卡林后,可以抑制腦缺血再灌注損傷所致的腦細胞凋亡,表明它具有神經(jīng)保護作用。這一作用與其逆轉(zhuǎn)Bcl-2表達下調(diào),逆轉(zhuǎn)Bax的表達上調(diào)以及對抗Caspase-3的表達上調(diào)有關(guān)。免疫組化的實驗結(jié)果證實,在正常大鼠腦皮層中作為維持血腦屏障的成員之一的MMP-9呈現(xiàn)致密分布。大鼠發(fā)生缺氧腦損傷后,腦皮層組織中MMP-9的表達下降,血腦屏障通透性增加;8mg/kg的埃他卡林組大鼠腦皮層MMP-9的表達顯著上升。

18、正常大鼠腦組織中有一定量的pCREB表達,大鼠缺氧缺血腦損傷后pCREB的表達明顯少于正常組,而給予埃他卡林的大鼠,腦組織中可見pCREB的表達較之模型組顯著上升。pCREB可促進下游促神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放和細胞存活。
　　二、埃他卡林對大鼠缺氧腦損傷線粒體功能的影響
　　1、埃他卡林對大鼠缺氧腦損傷腦線粒體形態(tài)的影響
　　缺氧缺氧損傷組大鼠腦線粒體,單位面積內(nèi)數(shù)量下降,HE染色結(jié)果可見大部分線粒體膜出現(xiàn)破損的狀態(tài),線粒

19、體嵴間隙變大,出現(xiàn)空泡。缺氧損傷后給予埃他卡林2mg/kg,線粒體數(shù)量有所增加,線粒體膜破損減輕,嵴間隙變小。
　　2、埃他卡林對大鼠缺氧腦損傷腦線粒體功能的影響
　　大鼠缺氧腦損傷后,利用氧電極檢查腦線粒體的各項指標發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn),缺氧損傷組的ATP合成速率下降至(117.32±1.72),較之正常對照組(128.82±9.68),下降明顯,P﹤0.05。而埃他卡林能增加大鼠缺氧腦損傷腦線粒體ATP合成速率達到(128.43±1

20、.12);埃他卡林能增加大鼠缺氧腦損傷腦線粒體磷/氧比即P/O比值(2.11±0.05)較之缺氧損傷組(2.08±0.04),有顯著差異;埃他卡林能增強大鼠缺氧腦損傷腦線粒體的呼吸率(respiratory controlrate,RCR)為(3.11±0.24),較之缺氧損傷組(2.91±0.23)有統(tǒng)計學差異。可見埃他卡林可以維持缺氧損傷線粒體后的形態(tài)和功能。
　　3、埃他卡林對缺氧損傷神經(jīng)血管單元細胞線粒體膜電位的影響

21、>　　經(jīng)過缺氧損傷后NVU細胞經(jīng)羅丹明123染色,發(fā)現(xiàn)羅丹明123的熒光強度都明顯下降,說明線粒體膜電位明顯下降。而埃他卡林預處理過的細胞經(jīng)缺氧損傷之后,線粒體膜電位的下降得到一定程度的逆轉(zhuǎn)。
　　4、埃他卡林對維持神經(jīng)血管單元細胞膜電位作用差異比較
　　埃他卡林對神經(jīng)元線粒體膜電位的維持作用和對內(nèi)皮細胞的作用存在顯著區(qū)別。
　　5、埃他卡林對缺氧損傷神經(jīng)血管單元ROS生成的影響
　　采用DCFH-DA探針測定細