ANXA11沉默影響慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞惡性行為及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一種造血干細(xì)胞異?？寺〉膼盒阅[瘤，大約占所有癌癥的0.3％，占成人白血病的20％，95％的CML病例呈BCR-ABL陽性。BCR-ABL融合基因由9號和22號染色體易位形成，編碼原癌蛋白BCR-ABL，該蛋白具持續(xù)激活的酪氨酸激酶活性，BCR-ABL酪氨酸激酶可激活下游信號通路促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)增殖、增強(qiáng)細(xì)胞遷移、干擾細(xì)胞正常凋亡、阻斷細(xì)胞分化，最終引發(fā)

2、CML。ANXA11（AnnexinA11，膜聯(lián)蛋白A11）為膜聯(lián)蛋白家族一員，是Ca2+依賴性膜結(jié)合蛋白，廣泛表達(dá)于除酵母以外的真核細(xì)胞中。研究表明ANXA11表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤惡性轉(zhuǎn)變、耐藥性及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，但與白血病的關(guān)系鮮有報(bào)道。
　　目的:1、構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞，篩選得到ANXA11表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的K562單克隆細(xì)胞株;2、研究ANXA11下調(diào)對K56

3、2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;3、探究ANXA11調(diào)控K562細(xì)胞生物行為相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:1、根據(jù)人源ANXA11的mRNA序列，設(shè)計(jì)針對其特異的shRNA及無關(guān)序列作為陰性對照，并構(gòu)建到pGPU6/GFP/Neo表達(dá)載體中;2、利用Lipo fetamin2000轉(zhuǎn)染試劑，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞，G418篩選及有限稀釋法得到相應(yīng)單克隆細(xì)胞株，采用qPCR和Western b lot方法檢測穩(wěn)定下調(diào)表達(dá)ANXA1

4、1的K562單克隆細(xì)胞株;3、倒置顯微鏡觀察ANXA11沉默對K562細(xì)胞形態(tài)的影響;4、CCK-8檢測ANXA11沉默對K562細(xì)胞體外增殖能力的影響;5、甲基纖維素集落實(shí)驗(yàn)檢測ANXA11沉默對K562細(xì)胞體外克隆形成能力的影響;6、Transwell檢測ANXA11沉默對K562細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的影響;7、qPCR、Western blot分析ANXA11下調(diào)對K562細(xì)胞中相關(guān)分子表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:1、篩選得到

5、穩(wěn)定下調(diào)表達(dá)ANXA11的K562單克隆細(xì)胞株（K562-shANXA11）及無關(guān)序列單克隆細(xì)胞株（K562-shNC）。與K562-shNC細(xì)胞相比，K562-shAN XA11中ANXA11在mRNA和蛋白水平分別下調(diào)了94％和95％;2、K562-shANXA11較K562-shNC細(xì)胞增殖明顯受到抑制;3、K562-shANXA11較K562-shNC細(xì)胞克隆形成數(shù)下降了45％;4、K562-shANXA11較K562-shNC

6、細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)分別減少了36％和43％;5、K562-shANXA11較K562-shNC細(xì)胞形態(tài)變大，且K562-shANXA11細(xì)胞中巨核細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD61表達(dá)明顯上調(diào)(2.27倍);6、ANXA11沉默抑制了STAT5b、Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-6、FAK、MMP-2的表達(dá)及STAT5和FAK磷酸化;ANXA11沉默上調(diào)了MEK1/2、ERK2磷酸化及Elk1和TIMP-1的表達(dá)。
　　結(jié)論:1、成功獲

7、得穩(wěn)定下調(diào)表達(dá)ANXA11的K562單克隆細(xì)胞株K562-shANXA11;2、ANXA11沉默明顯抑制K562細(xì)胞的體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力;3、ANXA11沉默誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化;4、ANXA11沉默可通過抑制STAT5相關(guān)的信號通路調(diào)控K562細(xì)胞增殖、克隆形成;ANXA11沉默可通過抑制FAK相關(guān)的信號通路調(diào)控K562細(xì)胞遷移、侵襲。另外，ANXA11沉默可能通過激活MEK/ERK2/ElK1通路誘導(dǎo)K56