FasL和屋塵螨基因共轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)屋塵螨致敏-激發(fā)小鼠免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、支氣管哮喘(哮喘)是一種由多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1,2]?！癟h1/Th2偏移”假說被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的主要免疫學(xué)機(jī)制，該假說認(rèn)為Th2細(xì)胞的過度活化導(dǎo)致了Th2反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多在哮喘的氣道炎癥發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[3-5]。目前研究發(fā)現(xiàn)，“Th1/Th2偏移”假說不能完全解釋哮喘的免疫學(xué)機(jī)制異常，近年提出了“免疫耐受缺陷”的假說。正

2、常人接觸過敏原后不會(huì)發(fā)生Th2細(xì)胞的過度活化，這是因?yàn)檎Ｈ丝梢詫?duì)過敏原產(chǎn)生免疫耐受。而哮喘患者由于免疫耐受缺陷導(dǎo)致接觸過敏原后T細(xì)胞異?；罨鲋澈头只癁門h2細(xì)胞，引起“Th1/Th2偏移”，始動(dòng)哮喘的氣道炎癥?！懊庖吣褪苋毕荨钡募僬f從更深的層次解釋了哮喘發(fā)病的免疫學(xué)異常。 樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是目前已知功能最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞(antigenpresentingcell，APC)，它既是氣道變應(yīng)性

3、炎癥的始動(dòng)因素，也可能是介導(dǎo)免疫耐受的樞紐環(huán)節(jié)，在激發(fā)免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受兩方面均起關(guān)鍵作用[6-9]。Fas/FasL介導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡是機(jī)體誘導(dǎo)和維持外周免疫耐受的重要機(jī)制[10,11]。將FasL基因轉(zhuǎn)染到DC等APC能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)相關(guān)抗原的不反應(yīng)性[12-15]。這種誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的DC被稱為“殺手”DC。本實(shí)驗(yàn)將屋塵螨(housedustmite，HDM)主要變應(yīng)原DerpⅡ和FasL基因共轉(zhuǎn)染DC獲得基因轉(zhuǎn)染

4、的FasL-DerpⅡ-DC，研究FasL-DerpⅡ-DC誘導(dǎo)HDM致敏/激發(fā)小鼠對(duì)過敏原特異性免疫耐受的作用和機(jī)制，并分別將DerpⅡ和FasL轉(zhuǎn)染DC得到DerpⅡ-DC和FasL-DC，將它們分別與FasL-DerpⅡ-DC比較，觀察誘導(dǎo)免疫耐受的作用和機(jī)制的異同。 研究?jī)?nèi)容和方法： 1.小鼠FasL(mFasL)基因的克隆及載體構(gòu)建：RT-PCR法擴(kuò)增mFasLcDNA全長(zhǎng)基因序列，并將其克隆至真核表達(dá)載體pI

5、RES2EGFP上。 2.構(gòu)建DerpⅡ和FasL基因共表達(dá)真核表達(dá)載體：將pIRES2EGFP的EGFP片段雙酶切下來，將DerpⅡ基因克隆入原EGFP所在位點(diǎn)，可得重組pIRES2EGFP-DerpⅡ，將FasL基因克隆入重組pIRES2EGFP-DerpⅡ的多克隆位點(diǎn)，使DerpⅡ和FasL基因均克隆至pIRES2EGFP上。 3.DC的分離、培養(yǎng)和鑒定：分離小鼠骨髓細(xì)胞，在含GM-CSF的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。流式

6、細(xì)胞儀(floWcytometry,FCM)鑒定培養(yǎng)細(xì)胞表面分子CD8α、CD11c、MHCⅡ和CD80分子。 4.基因轉(zhuǎn)染DC中目的基因表達(dá)的鑒定：應(yīng)用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑將DerpⅡ和FasL基因共表達(dá)載體、DerpⅡ基因表達(dá)載體、FasL基因表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染DC得FasL-DerpⅡ-DC，DerpⅡ-DC和FasL-DC，RT-PCR、Westernblot及免疫熒光法鑒定基因轉(zhuǎn)染DC中目的基因

7、的表達(dá)情況。 5.DerpⅡ和FasL基因共表達(dá)載體、DerpⅡ基因表達(dá)載體、FasL基因表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染對(duì)DC表面分子CD80、CD86、MHCⅡ表達(dá)和DC自身凋亡率的影響：FCM。 6.建立HDM致敏/激發(fā)小鼠肺部變應(yīng)性炎癥模型：用HDM提取液經(jīng)腹腔注射和霧化吸入途徑來致敏和激發(fā)小鼠。 7.基因轉(zhuǎn)染DC對(duì)HDM致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞和正常小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞增殖、凋亡和分泌細(xì)胞因子的影響：分離HD

8、M致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞和正常小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，分別與FasL-DerpⅡ-DC、DerpⅡ-DC、FasL-DC和未轉(zhuǎn)染DC(對(duì)照DC)共培養(yǎng)后，MTT檢測(cè)CD41+T細(xì)胞增殖，AnnexinV/PI雙染色后FCM法和TUNEL/CD3雙染色法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞凋亡情況，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的變化。 8.基因轉(zhuǎn)染DC對(duì)HDM致敏/激發(fā)小鼠氣道炎癥的影響：將FasL-

9、DerpⅡ-DC、DerpⅡ-DC、FasL-DC和對(duì)照DC分別經(jīng)氣管注入HDM致敏/激發(fā)小鼠體內(nèi)，病理切片觀察小鼠肺部炎癥變化，計(jì)算BALF細(xì)胞總數(shù)并進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，ELISA檢測(cè)BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平。 結(jié)果： 1.用RT-PCR法成功擴(kuò)增出mFasLcDNA全長(zhǎng)序列，并將其克隆至真核表達(dá)載體pIRES2EGFP得pIRES2EGFP-mFasL(pFasL)，測(cè)序表明序列完全正確。 2.

10、DerpⅡ基因克隆至pIRES2EGFP得pIRES2EGFP-DerpⅡ(pDerpⅡ)，mFasL基因克隆至pIRES2EGFP-DerpⅡ得DerpⅡ和mFasL基因共表達(dá)載體pIRES2EGFP-DerpⅡ-mFasL(pFasL-DerpⅡ)，測(cè)序表明DerpⅡ和mFasL基因序列完全正確。 3.獲得的骨髓來源的DC以未成熟型為主。 4.pFasL-DerpⅡ、pDerpⅡ和pFasL分別轉(zhuǎn)染DC后，RT-PC

11、R可檢測(cè)到相應(yīng)目的基因mRNA的表達(dá)，Westernblot法和免疫熒光法可檢測(cè)到相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)，而對(duì)照DC不能檢測(cè)到DerpⅡ和mFasL的mRNA和蛋白的表達(dá)。 5.pFasL-DerpⅡ、pDerpⅡ和pFasL轉(zhuǎn)染對(duì)DC表面分子CD80、CD86、MHCⅡ的表達(dá)無影響，仍以未成熟型為主。 6.與對(duì)照DC比較，pFasL-DerpⅡ、pDerpⅡ和pFasL轉(zhuǎn)染后，DC自身凋亡率未見顯著變化，表明DerpⅡ和F

12、asL基因共轉(zhuǎn)染、FasL基因轉(zhuǎn)染并未導(dǎo)致DC凋亡。 7.HDM致敏/激發(fā)小鼠肺部呈現(xiàn)顯著變應(yīng)性炎癥，BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)比例顯著增高，BALF和血漿中IL-4、IL-5水平顯著升高，IFN-γ水平顯著降低。 8.FasL-DerpⅡ-DC、FasL-DC不能誘導(dǎo)HDM致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞和正常小鼠脾臟CD41+T細(xì)胞對(duì)HDM刺激的增殖反應(yīng)。DerpⅡ-DC誘導(dǎo)HDM致敏/激發(fā)小鼠脾臟C

13、D4+T細(xì)胞和正常小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞對(duì)HDM刺激的增殖反應(yīng)較對(duì)照DC顯著減弱，表明DerpⅡ-DC能誘導(dǎo)CD4+Y細(xì)胞對(duì)HDM刺激的低反應(yīng)性。 9.FasL-DerpⅡ-DC能誘導(dǎo)HDM致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞凋亡和少數(shù)正常小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞凋亡。在HDM的刺激下，F(xiàn)asL-DC能誘導(dǎo)HDM致敏/激發(fā)小鼠CD4+T細(xì)胞凋亡和少數(shù)正常小鼠CD4+T細(xì)胞凋亡，而無HDM刺激，F(xiàn)asL-DC不能誘導(dǎo)HDM致敏/激發(fā)小鼠

14、脾臟CD4+T細(xì)胞和正常小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞凋亡。DerpⅡ-DC和對(duì)照DC不能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞凋亡。 10.基因轉(zhuǎn)染后的FasL-DerpⅡ-DC、FasL-DC和DerpⅡ-DC均能抑制HDM致敏/激發(fā)小鼠CD4+T細(xì)胞IL-4和IL-5的分泌，增加IFN-γ的分泌，對(duì)正常小鼠CD4+T細(xì)胞分泌IL-4、IL-5和IFN-γ無顯著影響，其中FasL-DerpⅡ-DC抑制HDM致敏/激發(fā)小鼠CD4+T細(xì)胞分泌IL-4和IL

15、-5的作用最強(qiáng)。 11.經(jīng)氣管分別注入FasL-DerpⅡ-DC、FasL-DC和DerpⅡ-DC過繼處理HDM致敏/激發(fā)小鼠，能顯著地減輕致敏/激發(fā)小鼠肺部變應(yīng)性炎癥，減少BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS比例、降低BALF中IL-4、IL-5的水平和增高IFN-γ水平，其中FasL-DerpⅡ-DC處理最為顯著，與正常組無顯著差異。 結(jié)論： 1.DerpⅡ和FasL基因共轉(zhuǎn)染DC和經(jīng)HDM過敏原刺激的FasL基因轉(zhuǎn)染