副溶血弧菌OpaR調(diào)控子調(diào)控生物膜的研究.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一種革蘭陰性嗜鹽弧菌。常存在于近海岸海水、海產(chǎn)品及鹽漬食品中,日本、美國(guó)和東南亞國(guó)家是其主要分布地區(qū),是這些國(guó)家重要的食源性致病菌,當(dāng)然也是我國(guó)沿海地區(qū)最常見(jiàn)的食物中毒病原菌,由VP菌引起的食物中毒案例約占這些地區(qū)食源性中毒案件的30％以上,浙江省則高達(dá)60％。當(dāng)人們食用生的或烹煮不徹底的魚(yú)、蝦、蟹、貝等海產(chǎn)品時(shí)就有可能感染副溶血弧菌,表現(xiàn)為發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉

2、等急性胃腸炎癥狀,嚴(yán)重者如治療不及時(shí)有可能發(fā)展成敗血癥,引起死亡。由于VP菌的廣泛流行和日益增高的中毒病例,很有必要對(duì)其致病機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　 副溶血弧菌在生存過(guò)程中是能形成生物膜的,跟霍亂弧菌,哈氏弧菌及創(chuàng)傷弧菌一樣,生物膜在其適應(yīng)環(huán)境和廣泛傳播過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。副溶血弧菌OpaR,霍亂弧菌HapR及創(chuàng)傷弧菌SmcR均是哈氏弧菌LuxR的同源物,四者同為QS系統(tǒng)核心調(diào)控子。QS系統(tǒng)常常涉及到生物膜的形成,已有霍亂弧菌

3、HapR調(diào)控生物膜形成的報(bào)道。早期的研究表明OpaR基因調(diào)控細(xì)菌的透明度和群集性爬動(dòng),但對(duì)其調(diào)控生物膜形成的詳細(xì)機(jī)制研究少見(jiàn)。
　　 目的:本研究目的在于探究副溶血弧菌RIMD2210633 OpaR調(diào)控子控制的生物膜表型,鑒定其靶基因,尤其是直接調(diào)控的靶基因,進(jìn)一步研究OpaR對(duì)其下游直接靶基因的精細(xì)調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:本研究首先用自殺載體PDS132同源重組的方法敲除OpaR調(diào)控子,構(gòu)建副溶血弧菌RIMD2210

4、633菌株的ΔOpaR無(wú)痕突變株,然后比較野生株和Δ OpaR突變株在透明度、生長(zhǎng)曲線及生物膜形成的一系列表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中生長(zhǎng)曲線比較營(yíng)養(yǎng)不同的M和MV5培養(yǎng)基在24℃和37℃兩個(gè)溫度下的生長(zhǎng)狀態(tài),結(jié)晶紫染色作為生物膜定量分析方法。同時(shí)采用含His標(biāo)簽的pET28a為載體,大腸桿菌菌株BL21(DE3)為表達(dá)宿主,用實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)的重組克隆方法表達(dá)OpaR蛋白,鎳柱純化得到高純度的His-OpaR蛋白,對(duì)其DNA結(jié)合活性進(jìn)行分析:首先與其

5、直系同源物進(jìn)行序列比對(duì),然后對(duì)自身基因及推定的生物膜相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行EMSA,檢測(cè)這些靶基因啟動(dòng)子區(qū)與Hs-OpaR蛋白結(jié)合活性,接下來(lái)的DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)則對(duì)二者結(jié)合區(qū)域作序列上的分析。
　　 結(jié)果:用自殺載體PDS132同源重組的方法成功構(gòu)建副溶血弧菌RIMD2210633菌株的Δ OpaR無(wú)痕突變株。表型實(shí)驗(yàn)中,在透明度分析上,Δ OpaR突變株是透明的,而野生株不透明,與文獻(xiàn)相符；從生長(zhǎng)曲線看,二者在富營(yíng)養(yǎng)

6、的M培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯差異,而在低營(yíng)養(yǎng)的MV5培養(yǎng)基,Δ OpaR無(wú)痕突變株生長(zhǎng)狀態(tài)比野生株好；生物膜結(jié)晶紫染色結(jié)果示△OpaR突變株生物膜形成能力要強(qiáng)于野生株。同時(shí)成功表達(dá)純化了His-OpaR蛋白,序列比對(duì)結(jié)果示其與另三種弧菌的直系同源物存在高度同源性,自身基因OpaR(VP2516)及生物膜相關(guān)基因scrG(VP1377)的EMSA和DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)看出其有較高的DNA結(jié)合活性,同時(shí)也明確了它們與His-OpaR蛋白的結(jié)

7、合序列,說(shuō)明這兩個(gè)基因受OpaR調(diào)控。
　　 結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了副溶血弧菌RIMD2210633菌株的ΔOpaR無(wú)痕突變株,搭建了基于自殺載體的VP菌基因敲除方法的平臺(tái)；生長(zhǎng)曲線提示低營(yíng)養(yǎng)條件下,OpaR基因能影響其生長(zhǎng)狀態(tài)；通過(guò)生物膜結(jié)晶紫染色估計(jì)OpaR可能通過(guò)某種機(jī)制抑制生物形成；EMSA和DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)說(shuō)明OpaR作為QS系統(tǒng)的核心調(diào)控子,其具較高的DNA結(jié)合活性,DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)也明確了OpaR(VP25