頭頸部副神經(jīng)節(jié)瘤患者琥珀酸脫氫酶基因致病突變研究.pdf

1、頭頸部副神經(jīng)節(jié)瘤是一種少見(jiàn)腫瘤疾病，好發(fā)于頸動(dòng)脈體、頸靜脈窩、鼓室和迷走神經(jīng)等部位。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，副神經(jīng)節(jié)瘤與琥珀酸脫氫酶（succinatedehydrogenase，SDH）亞單位的編碼基因突變相關(guān)。為掌握中國(guó)人群頭頸部副神經(jīng)節(jié)瘤患者中琥珀酸脫氫酶基因的突變特點(diǎn)以及對(duì)疾病的影響，本研究搜集家族性和散發(fā)頭頸部副神經(jīng)節(jié)瘤患者DNA樣本和臨床資料，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)和遺傳學(xué)研究方法，對(duì)患者的SDH基因突變進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　

2、本研究共分為四個(gè)部分：
　　 第一部分頭頸部副神經(jīng)節(jié)瘤患者臨床資料和DNA樣本的搜集
　　 本部分研究工作查閱自2002年至今在我院經(jīng)手術(shù)治療后病理證實(shí)為副神經(jīng)節(jié)瘤患者病歷，設(shè)計(jì)臨床信息登記表，聯(lián)系患者進(jìn)行回訪，并邀請(qǐng)其參與本研究。在獲得知情同意后，詳細(xì)完善臨床資料及家系情況，獲取患者血樣并提取DNA備用。對(duì)近期手術(shù)的患者以及研究階段新入院的患者，在復(fù)查隨訪和術(shù)后階段亦納入本研究中。同時(shí)，從病理科調(diào)取所有患者的腫瘤組織石

3、蠟包埋腫瘤組織標(biāo)本，提取DNA備用。共搜集頭頸部副神經(jīng)節(jié)瘤患者血樣34例，石蠟包埋組織樣本83例（含34例已獲取血樣的患者）。提取了34例患者的血樣DNA（男性9例、女性25例）和30例患者（男性13例、女性17例）的石蠟包埋組織樣本DNA。
　　 第二部分琥珀酸脫氫酶基因點(diǎn)突變檢測(cè)
　　 本部分研究對(duì)64例頭頸部副神經(jīng)節(jié)瘤患者的DNA樣本進(jìn)行了SDHB、SDHC、SDHD和SDHAF2基因突變檢測(cè)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)SD

4、HB、SDHC和SDHD基因各外顯子擴(kuò)增引物（SDHAF2使用文獻(xiàn)引物），經(jīng)PCR擴(kuò)增后行序列分析。BLAST序列對(duì)比找出SDH基因突變，并通過(guò)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比、突變類(lèi)型分析、突變位點(diǎn)物種保守性分析等方法，判斷其致病性。對(duì)特殊突變通過(guò)PCR擴(kuò)增子質(zhì)?？寺〖皢慰寺y(cè)序分析進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 本部分研究發(fā)現(xiàn)48.5％（31/64）的患者攜帶有SDHB（10例）、SDHC（3例）或SDHD（18例）基因突變，3者的檢出率分別為1

5、6％、5％和2896，未發(fā)現(xiàn)有患者攜帶SDHAF2基因突變。其中發(fā)現(xiàn)了9種新突變，部分結(jié)果已提交至SDH突變數(shù)據(jù)并可在線查詢(xún)。34例獲取了靜脈血樣的患者中，61.7％（21/34）攜帶有SDH基因突變（SDHB7例，SDHC3例，SDHD11例）；30例檢測(cè)腫瘤石蠟包埋組織樣本DNA的患者中，僅33.3％（10/30）發(fā)現(xiàn)攜帶有SDH基因突變（SDHB4例，SDHD7例），小于靜脈血樣組，p<0.005。
　　 6例家族性患者均

6、攜帶SDFID基因突變，占攜帶SDHD突變的患者總數(shù)的33％（6/18），6例多發(fā)腫瘤患者亦均為SDHD突變攜帶者，其中3例為家族性發(fā)病患者。2例惡性腫瘤患者均攜帶有SDH突變，SDHB和SDHD各1例。
　　 第三部分琥珀酸脫氫酶基因大片段缺失檢測(cè)
　　 本研究對(duì)PCR擴(kuò)增直接測(cè)序未發(fā)現(xiàn)有突變的33例患者運(yùn)用多重連接依賴(lài)式探針擴(kuò)增技術(shù)對(duì)SDH基因的各外顯子進(jìn)行了拷貝數(shù)異常檢測(cè)。未發(fā)現(xiàn)有患者的SDH基因拷貝數(shù)有異常，說(shuō)明

7、無(wú)染色體重排引起的SDH基因區(qū)域大片段缺失。
　　 第四部分多發(fā)突變的單體型分析和創(chuàng)始者效應(yīng)分析
　　 對(duì)SDHD基因中出現(xiàn)的多發(fā)突變，通過(guò)構(gòu)建各家系的微衛(wèi)星單體型并將各患者的單體型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)攜帶SDHD c.3G>C突變的4例患者中，有3個(gè)患者有相同的微衛(wèi)星等位基因組合。在75例正常人群中統(tǒng)計(jì)了各等位基因的頻率，判斷他們共享的等位基因組合在正常人群中的概率僅2×10-8～5×10-5，4個(gè)不相關(guān)的家系同時(shí)攜帶此組合