人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向光感受器細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在體外定向分化成為視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞所需的微環(huán)境，為臨床上治療視網(wǎng)膜變性疾病提供新思路。
　　 方法：無菌條件下自5位健康成年自愿骨髓捐贈(zèng)者髂前上棘采集骨髓，采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離純化獲得BMSCs進(jìn)行原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)傳代至第3代的BMSCs行流式細(xì)胞術(shù)鑒定，將第3代的BMSCs以含10％FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基中加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因

2、子(EGF)及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)三種因子首先進(jìn)行第一階段向神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化，對(duì)照組不用任何因子誘導(dǎo)，只用含10％FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基培養(yǎng)。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)后巢蛋白及微管相關(guān)蛋白-2的表達(dá)情況，連續(xù)檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間巢蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率，當(dāng)誘導(dǎo)至巢蛋白陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到最高時(shí)更換誘導(dǎo)因子，向培養(yǎng)基中加入色素上皮衍生因子(PEDF)及?；撬?Taurine)進(jìn)行第二階段誘導(dǎo)2w，用免疫細(xì)胞化學(xué)及RT-PCR方法檢

3、測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞視紫紅質(zhì)的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)BMSCs第3d開始免疫細(xì)胞化學(xué)能檢測(cè)到巢蛋白表達(dá)，第12d巢蛋白陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到最高，達(dá)(90.9±2.6)％，14d時(shí)巢蛋白陽(yáng)性率減低為(75.5±3.7)％。微管相關(guān)蛋白-2在誘導(dǎo)第6d檢測(cè)到陽(yáng)性表達(dá)。第12d誘導(dǎo)因子更換為PEDF及Taurine繼續(xù)誘導(dǎo)2w后，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)到有視紫紅質(zhì)表達(dá)，第2w視紫紅質(zhì)陽(yáng)性率為(20.7±3.8)％，對(duì)照組均末檢測(cè)到視紫紅質(zhì)

4、表達(dá)。在誘導(dǎo)第2w后采用RT-PCR方法檢測(cè)到誘導(dǎo)細(xì)胞有視紫紅質(zhì)表達(dá)；對(duì)照組未見視紫紅質(zhì)表達(dá)。
　　 結(jié)論：體外采用分階段誘導(dǎo)BMSCs，第一階段應(yīng)用因子bFGF、EGF及BDNF進(jìn)行向神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化，BMSCs能夠成功向神經(jīng)前體細(xì)胞分化，呈現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞樣形態(tài)，表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白及神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白。第二階段應(yīng)用因子PEDF和Taurine能在體外誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)光感受器細(xì)胞標(biāo)志物視紫紅質(zhì)，結(jié)果顯示B