hPXR基因單核苷酸多態(tài)性及其單倍型與CYP3A4代謝表型的關(guān)系.pdf

1、藥物代謝是藥物在體內(nèi)消除的主要決定因素。藥物在體內(nèi)代謝向兩個方向發(fā)展：代謝解毒和代謝活化，其中大部分藥物的代謝在肝臟進行。細胞色素(CYP450)酶系是肝臟中主要的代謝酶系，其中CYP3A4是細胞色素P450系統(tǒng)的重要亞型，占肝臟中P450酶總含量的25％，臨床上50％的藥物通過此酶代謝而排出體外。臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，大多通過CYP3A4．代謝的藥物都存在顯著的個體差異和種族差異，這對于治療窗窄、安全指數(shù)低的藥物很易發(fā)生藥物毒性反應(yīng)和達不到

2、療效。并且絕大部分藥物因需要長期應(yīng)用和合并用藥，常發(fā)生自身代謝誘導(dǎo)，即隨著藥物應(yīng)用時間和劑量的增加，藥物在體內(nèi)的代謝增強，從而需不斷加大用藥劑量。但不同患者增加強度不同。 近年來一系列研究發(fā)現(xiàn)，人孕烷X受體(human pregnane X receptor, hPXR)作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與CYP3A4基因誘導(dǎo)表達。hPXR可以被許多臨床藥物激活，包括鈣通道拮抗劑、抑制素、降糖藥、HIV蛋白酶抑制劑、抗激素藥、抗癌藥，這些

3、藥物的大多數(shù)都是依賴CYP3A4代謝而排出體外的。hPXR基因已進行了功能研究的29個SNP中，發(fā)生在編碼區(qū)的11個SNP有7個可引起hPXR蛋白序列的差異，經(jīng)細胞重組表達研究顯示出利福平誘導(dǎo)CYP3A4轉(zhuǎn)錄活化的差異；另外，在3，端和5’端非編碼區(qū)及近端內(nèi)含子的18個SNP中，經(jīng)細胞重組表達研究已明確有8個SNP影響藥物代謝酶CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達。 目的： 第一部分hPXR基因SNP檢測及單倍型分析 在中國健

4、康漢族人群中廣泛篩查hPXR基因的SNP，明確其單倍型分布，并與其它種族比較，明確種族差異。 方法： 用PCR-直接測序法對hPXR基因的編碼區(qū)、近端內(nèi)含子、3’及5'-UTR的SNP進行廣泛篩查，計算各SNP頻率，并驗證是否符合Hardy—Weinberg平衡。與其它種族比較SNP頻率差別采用x<'2>檢驗。PHASE V.2.1進行單倍型分析。 結(jié)論： 中國健康漢族人群發(fā)現(xiàn)16種SNP，其中未見報道的

5、新SNP有2個(-25439A>G和7637C>T)；有9個為在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中直接登陸而未經(jīng)確證的SNP(其中兩個位于hPXR基因啟動子的關(guān)鍵部位，本研究將在第二部分對這兩個突變的功能進行進一步的研究)；另外，本試驗發(fā)現(xiàn)的SNP的種類，頻率和常見的單倍型的種類與已報道的其它種族存在顯著性差異。 目的： 第二部分 hPXR啟動子區(qū)域的突變-24622A>T 與-24446C>A的功能研究 第一部

6、分試驗中在hPxR基因啟動子的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域發(fā)現(xiàn)一24622A>T及一24446C>A兩個突變，發(fā)生頻率分別為3.5％及2.4％，前者在美國黑人中有報道(發(fā)生率3.1％)，后者僅見于亞洲人群(發(fā)生率3.6％)，在高加索人和美國黑人中未見報道。鑒于此兩突變所處位置，推測可能會影響hPXR自身表達，從而影響受hPXR調(diào)控的下游基因的轉(zhuǎn)錄與表達。用報告基因的方法檢測這兩個突變對hPxR啟動子功能的影響。 方法： 通過構(gòu)建三種1.

7、2kPxR—pGL3—Basic表達質(zhì)粒(T—24622T—pGL3、A-24446A—pGL3與靶片段無突變—pGL3)，以pGL3重組質(zhì)粒與phRL—CMV共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，考察一24622A>T及—24446C>A對PXR自身表達的影響。t-檢驗進行統(tǒng)計學(xué)評價，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 這兩個發(fā)生于hPXR基因啟動子關(guān)鍵區(qū)域的SNP-24622A>T與-24446C>A使PXR自身轉(zhuǎn)錄活性增強。

8、 第三部分 CYP3A4底物硝苯地平的質(zhì)譜檢測方法的建立與確認 目的： 硝苯地平經(jīng)CYP3A4代謝，因而常用作探針藥反應(yīng)CYP3A4代謝活性。本實驗將在第四部分考察hPXR的不同單倍型對與CYP3A4代謝表型的關(guān)系，將以硝苯地平為探藥。故先建立硝苯地平及其代謝物氧化硝苯地平的質(zhì)譜檢測方法，并進行驗證，為下一步檢測受試者血漿中硝苯地平及氧化硝苯地平濃度，從而反應(yīng)相應(yīng)的CYP3A4活性奠定基礎(chǔ)。 方法：

9、1．建立硝苯地平及其代謝物氧化硝苯地平檢測的質(zhì)譜方法、液相方法及血漿樣本的萃取方法。 2．進行全面的方法學(xué)驗證：包括方法的精密度、準確度、線性及最低檢測限、穩(wěn)定性及基質(zhì)效應(yīng)等。 結(jié)果： 1．建立了硝苯地平及其代謝物氧化硝苯地平的LC/MS/MS的檢測方法。萃取方法以尼群地平為內(nèi)標，以無水乙醚：正己烷(3:1，v/v)為萃取劑。質(zhì)譜條件為：離子源EST，正離子掃描及選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)，監(jiān)測離子為：m/z 3

10、47.1→315.0(硝苯地平)，m/z 345.1→248.3(氧化硝苯地平)及m/z 361.0→315.0(內(nèi)標)。液相條件：分離柱Hypersil BDS C18(150 mm×2.1 mm，i.d.，3μm，Elite HPLC，China)、流動相為甲醇—水(80:20，v/v)(0.1％甲酸)，流速200μl/min。色譜保留時間為2.5分鐘。 2．方法學(xué)驗證：硝苯地平及氧化硝苯地平的線性范圍均為0.5-100 n

11、g/ml。兩者的萃取回收率分別為81.3-89.1％和71.6-80.4％，兩者的日內(nèi)及日間精密度、準確度、穩(wěn)定性的RSD及偏離度均小于15％，符合生物樣本檢測的要求。結(jié)論：建立了LC/MS/MS方法檢測人血漿中硝苯地平及氧化硝苯地平濃度，方法精密度、準確度好，靈敏度高，適用于人體藥動學(xué)研究。 目的： 本實驗主要考察hPXR誘導(dǎo)劑SJW(St John’s Wort，金絲桃素制劑)應(yīng)用前后，hPxR的不同單倍型對與CYP

12、3A4代謝表型的相關(guān)性，同時也考察了SNP-24622A>T和-24446C>A與CYP3A4代謝表型的相關(guān)性，為明確hPXR單倍型與CYP3A4藥物代謝表型間的關(guān)系，為探討CYP3A4代謝表型個體差異的原因提供試驗依據(jù)；最終為臨床用藥個體化提供理論指導(dǎo)。 方法： 1.以本試驗人群中最常見的兩種單倍型組成的三種單倍型對為研究對象，挑選10例受試者進入藥動學(xué)試驗研究。(4人hapl&1，3人hapl&2和3人hap2&2)

13、 2.對上述所選受試者的CYP3A4的基因型進行檢測，保證進入藥動學(xué)研究的受試者CYP3A4的基因型一致。 3.試驗為雙周期自身對照，受試者服用SJW片劑每日三次，每次300mg。試驗前后的CYP3A4活性用硝苯地平及其代謝物的AUC以及兩者的比值表示。硝苯地平及其代謝物的血藥濃度用LC/MS/MS檢測。4.試驗數(shù)據(jù)通過mean±SD表示，采用秩和非參數(shù)統(tǒng)計檢驗，P＜0.05認為具有顯著意義。結(jié)果： 1．Hapl&1，Hapl

14、&2和Hap2&2組中硝苯地平的藥動學(xué)特點 在服用誘導(dǎo)劑SJW前后，所有受試者硝苯地平的AUC均顯著下降，相應(yīng)地，對于代謝物氧化硝苯地平，AUC均顯著升高，經(jīng)t-檢驗，試驗前后的改變有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明PXR被SJW誘導(dǎo)后，使CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達增強，其底物(硝苯地平)的代謝加速，同文獻報道一致。 2．Hapl&2組中有與無突變-24622A>T對硝苯地平人體藥動學(xué)的影響 在Hapl&2組中

15、，兩名受試者具有突變-24622A>T，而兩名受試者無此突變。無論有無-24622A>T突變，受試者服用誘導(dǎo)劑后，硝苯地平的AUC均下降約40％～45％；但代謝物AUC的升高卻因有無-24622A>T突變而有差異，無-24622A>T突變的受試者代謝物AUC升高33.8％，而有-24622A>T的受試者代謝物AUC僅升高11.3％。不過經(jīng)秩和檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因而，該突變是否會對PXR的轉(zhuǎn)錄激活作用造成影響，還需進一步研究。

16、 3．Hap7&1l組中有與無突變-24446C>A對硝苯地平人體藥動學(xué)的影響 在第二部分實驗中，我們運用報告基因的方法發(fā)現(xiàn)突變-24446C>A使PXR自身表達顯著增強，推測其可能使PxR對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用增強。因而我們利用人體藥動學(xué)試驗對其進行初步驗證。不過，受試者的選擇非常困難，因為要保證入選的受試者的hPXR單倍型組成必須一致，但具有突變-24446C>A的7個健康志愿者中，其相互間的單倍型組成差異很大，很難找到

17、陰性對照，最終只入選了兩例受試者，單倍型組成為Hap7&ll，一個有-24446C>A突變，一個無此突變。 結(jié)論： 1．在中國人群常見的兩種hPXR基因單倍型組成的三種單倍型對中(Hapl＆1，Hapl＆2和Hap2&2)，Hap1&1對CYP3A4的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄激活作用最弱，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活作用最強。 2．單倍型組成Hap7＆11的hF)XR對腸道P—gp及CYP3A4的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活作用強于Hap1＆1，Hap1＆2和