CGRP修飾MSCs調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖對(duì)球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)研究.pdf

1、目的:
　　 經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，顯著地改善了冠心病的臨床療效及預(yù)后，但PCI術(shù)中對(duì)血管的機(jī)械損傷等所導(dǎo)致的術(shù)后血管內(nèi)再狹窄，仍是當(dāng)今臨床上未能解決的重要問題[1]。目前的研究表明，再狹窄的發(fā)生主要與內(nèi)皮損傷和血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移等所致的新生內(nèi)膜增生及血管重塑有關(guān)。本研究小組前期研究顯示[2]：MSCs移植能在一定程度上促進(jìn)損傷動(dòng)脈內(nèi)皮的修復(fù)，從而減輕術(shù)后血管內(nèi)狹窄的程度，但其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(VS

2、MCs)的作用相對(duì)較弱。由此，如果能通過相關(guān)目的基因修飾或優(yōu)化MSCs，使其在保護(hù)內(nèi)皮的同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)VSMCs增殖及內(nèi)膜增生的抑制作用，可能會(huì)有益于進(jìn)一步降低再狹窄。研究顯示：降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)作為一種廣泛存在于心血管系統(tǒng)的血管活性肽，具有顯著抑制VSMCs增殖的作用。那么，如果將CGRP基因轉(zhuǎn)染至MSCs，是否會(huì)增加MSCs的抗VSCMs增殖的效應(yīng)呢?為回答這個(gè)問題，本課題擬構(gòu)建含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的CGRP基因

3、的重組慢病毒(lentivirus，Lv)載體(Lv-EGFP-CGRP)并轉(zhuǎn)染至MSCs，首先在體外與VSMCs分組共培養(yǎng)，分別觀察其對(duì)VSMCs增殖、遷移及表型改變的影響。隨后將其體內(nèi)移植至球囊損傷頸動(dòng)脈的血管狹窄大鼠模型，在體內(nèi)觀察其CGRP修飾的MSCs移植對(duì)損傷動(dòng)脈VSCMs增殖及表型改變的影響，探討CGRP修飾MSCs移植在促進(jìn)損傷動(dòng)脈內(nèi)皮化的同時(shí)，是否還具有抑制VSMCs增殖等多重作用，從而為基因優(yōu)化的干細(xì)胞移植治療再狹窄

4、提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一部分：貼壁離心法培養(yǎng)大鼠MSCs并通過流式鑒定；將含EGFP和CGRP基因的重組慢病毒載體(LV-EGFP-CGRP)和空病毒載體(LV-EGFP)分別轉(zhuǎn)染至大鼠MSCs。采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)測定其轉(zhuǎn)染率；RT-PCR和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測CGRP的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測培養(yǎng)上清液中CGRP的濃度。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)分MSCs-CGRP，MS

5、Cs-EGFP和MSCs三組(n=3)，分別對(duì)轉(zhuǎn)染后的MSCs進(jìn)行MTT、β-半乳糖苷酶染色和誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)，了解病毒轉(zhuǎn)染對(duì)MSCs增殖、衰老和分化的影響。
　　 第二部分：組織貼壁法培養(yǎng)VSMCs；將Lv-EGFP-CGRP和Lv-EGFP轉(zhuǎn)染后的MSCs，分別與同步化后的VSMCs共培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為Lv-EGFP-CGRP-MSCs+VSMCs(MSCs-CGRP組)、Lv-EGFP-MSCs+VSMCs(MSCs-EGFP組

6、)、MSCs+VSMCs(MSCs組)和VSMCs四個(gè)組(對(duì)照組)(n=3)。行劃痕實(shí)驗(yàn)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率并計(jì)數(shù)；同時(shí)，共培養(yǎng)48小時(shí)后行FCM檢測VSMCs細(xì)胞周期和凋亡(Annexin V/PI)，WesternBlot檢測VSMCs的SM-α-action、OPN蛋白表達(dá)。
　　 第三部分：建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，將預(yù)先準(zhǔn)備好的Lv-EGFP-MSCs及Lv-EGFP-CGRP-MS

7、Cs于頸動(dòng)脈球囊損傷后即刻移植至損傷動(dòng)脈內(nèi)室溫孵育30min，
　　 實(shí)驗(yàn)分Lv-EGFP-CGRP-MSC移植組(MSCs-CGRP組，n=20)、Lv-EGFP-MSCs移植組(MSCs組，n=20)和等體積的PBS液注射組(對(duì)照組，n=16)。分別于細(xì)胞移植后7d、14d和28d取血管組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定：免疫熒光檢測EGFP和CD31觀察MSCs歸巢和分化情況；Western blot檢測局部CGRP的表達(dá)，HE染色檢測

8、血管組織形態(tài)學(xué)，免疫組織化學(xué)檢測局部PCNA表達(dá)；Westernblot檢測頸動(dòng)脈VSMCs的SM-α-action、OPN蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分：成功轉(zhuǎn)染慢病毒的大鼠MSCs可表達(dá)綠色熒光，48小時(shí)后可穩(wěn)定表達(dá)，當(dāng)MOI為30時(shí)，熒光顯微鏡及FCM測轉(zhuǎn)染率達(dá)80％以上；RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后的MSCs有CGRP基因mRNA表達(dá)；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CGRP的MSCs胞漿中有CGRP

9、的分泌，均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。同時(shí)，通過MTT、β-半乳糖苷酶染色和誘導(dǎo)分化分別檢測轉(zhuǎn)染后的MSCs，結(jié)果顯示MSCs增殖、衰老及分化未受影響。
　　 第二部分：劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：MSCs-CGRP組中VSMCs遷移能力明顯低于MSCs-EGFP組、MSCs組和對(duì)照組(P<0.05)，而后三組間比較無差異(P>0.05)。胎盤藍(lán)染色示各組細(xì)胞存活率均大于90％，細(xì)胞數(shù)也少于其他各組(P<0.05)。細(xì)胞周期檢查發(fā)現(xiàn)：

10、MSCs-CGRP組較其余三組處于G0/G1期的細(xì)胞更多、S期更少(P<0.05)；FCM檢測示：MSCs-CGRP組中VSMCs的早晚期凋亡數(shù)較其它組更高(P<0.05)，其余三組間比較無差異(P>0.05)；Western blot檢測MSCs-CGRP組的α-SM-action蛋白較其余各組表達(dá)增加(P<0.05)，而OPN蛋白表達(dá)較其余各組表達(dá)減少(P<0.05)。
　　 第三部分：MSCs-CGRP組和MSCs組頸動(dòng)脈

11、球囊損傷的內(nèi)膜在各時(shí)間點(diǎn)均有EGFP標(biāo)記的MSCs歸巢，且部分同時(shí)表達(dá)CD31，對(duì)照組則無；細(xì)胞移植后28d行Westernblot檢測：各組血管組織均有CGRP基因表達(dá)，MSCs-CGRP移植組較MSCs移植組和對(duì)照組表達(dá)明顯增加(P<0.05)，后兩組間比較無差異(P>0.05)。HE染色見對(duì)照組內(nèi)膜增生最明顯，同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞移植組新生內(nèi)膜/中膜面積均低于對(duì)照組，其中MSCs-CGRP移植組較明顯(P<0.05)；同時(shí)還觀察到PCNA

12、的表達(dá)在對(duì)照組最高，MSCs移植組次之，MSCs-CGRP移植組最低(P<0.05)：VSMCs表型改變Western blot檢測結(jié)果顯示：MSCs-CGRP組SM-α-action蛋白較MSCs組和對(duì)照組表達(dá)增加，但低于正常組(P<0.05)，MSCs-CGRP移植組的OPN表達(dá)較MSCs移植組和對(duì)照組減少，但多于正常組(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 第一部分：慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染大鼠MSCs并使其CGRP基

13、因表達(dá)增高，轉(zhuǎn)染后MSCs胞漿有CGRP蛋白分泌至上清，轉(zhuǎn)染后的MSC生物學(xué)特性未受影響。提示，MSCs是一種理想的基因載體細(xì)胞，可作為CGRP基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞用于基因治療。
　　 第二部分：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CGRP基因修飾的MSCs能抑制VSMCs的增殖、遷移和促進(jìn)凋亡，并能促進(jìn)VSMCs的表型從合成表型向收縮表型轉(zhuǎn)化，此結(jié)果為體內(nèi)基因治療奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 第三部分：在大鼠體內(nèi)，CGRP基因修飾的MSCs較單純MS