T7Select噬菌體展示單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建及抗CD44v6單鏈抗體的篩選.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一章全套抗體重鏈、輕鏈的克隆 目的： 從消化道腫瘤患者外周血中分離淋巴細(xì)胞，克隆人全套抗體重鏈、輕鏈基因，并重組連接成抗體庫(kù)構(gòu)建所需要的VH-linker-VL單鏈抗體基因。 方法： 在2006年10月1日至12月30日的住院病人中收集外周血：正常(2人×5ml/人)，胃癌(3人×5ml/人)，新生兒(2人×2ml/人)，結(jié)直腸癌(3人×5ml/人)，胰腺癌(

2、1人×5ml/人)。密度梯度分離人外周血淋巴細(xì)胞， RT-PCR方法擴(kuò)增全套重鏈、輕鏈基因：重疊延伸PCR法構(gòu)建重組VH-linker-VL單鏈抗體基因。PCR引物合成時(shí)引入Sal I、Not I酶切位點(diǎn)和linker連接片段(Gly4Ser)3。 結(jié)果： RT-PCR克隆得到重鏈基因產(chǎn)物長(zhǎng)度均在400bp左右，κ輕鏈基因產(chǎn)物長(zhǎng)度均在400bp左右，λ輕鏈基因產(chǎn)物長(zhǎng)度均在400bp左右。重疊延伸PCR構(gòu)建得到VH-lin

3、ker-VL(κ/λ)單鏈抗體基因，產(chǎn)物片段約800bp大小。 結(jié)論： 本部分實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了VH-linker-VL(κ/λ)單鏈抗體基因，為單鏈抗體庫(kù)的成功構(gòu)建提供基礎(chǔ)。 第二章T7Select單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建 目的：構(gòu)建F7Select單鏈抗體庫(kù)，并測(cè)定抗體庫(kù)的容量。 方法： 分別對(duì)單鏈抗體基因和T71-2b噬菌體載體DNA進(jìn)行雙酶切，然后用T4連接酶把單鏈抗體基因克隆進(jìn)T7載體DNA

4、，然后進(jìn)行噬菌體體外包裝，構(gòu)建初級(jí)抗體庫(kù)。系列倍比稀釋后鋪板，測(cè)定抗體庫(kù)庫(kù)容。初級(jí)抗體庫(kù)經(jīng)液體擴(kuò)增后得次級(jí)抗體庫(kù)，再次測(cè)定單鏈抗體庫(kù)庫(kù)容。 結(jié)果： 初級(jí)抗體庫(kù)庫(kù)容為1×103，次級(jí)抗體庫(kù)庫(kù)容為4×109。 結(jié)論： 本部分實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了T7Select單鏈抗體庫(kù)，庫(kù)容高達(dá)4×109，為篩選抗CD44v6單鏈抗體奠定了基礎(chǔ)。 第三章抗CD44v6單鏈抗體的篩選 目的： 篩選融合表達(dá)抗C

5、D44v6單鏈抗體的重組噬菌體，并PCR擴(kuò)增目的片段，進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定。 方法： FITC免疫熒光標(biāo)記觀察胃癌細(xì)胞系SGC7901 CD44v6蛋白表達(dá)情況。收集培養(yǎng)SGC7901 細(xì)胞，提取膜蛋白;然后從膜蛋白中免疫磁珠親和純化得到CD44V6蛋白。以CD44v6蛋白包被ELISA板，固相篩選抗CD44v6單鏈抗體三輪。PCR擴(kuò)增第三輪篩選得到的重組噬菌體，測(cè)序，并用Ig BLAST (http：//www．ncbi

6、．nlm．nih．gov/igblas/)進(jìn)行亞組分析。利用Geno3D (http：//geno3d-pbil．ibcp．fr/cgi-bin/geno3d_automat．pl?page=/GENO3D/geno3d_ho me．html)在線工具對(duì)單鏈抗體蛋白質(zhì)構(gòu)象進(jìn)行預(yù)測(cè)。 結(jié)果： SGC7901高表達(dá)CD44v6蛋白。平板試驗(yàn)顯示從第一輪篩選到第三輪篩選重組噬菌體表現(xiàn)出明顯的富集現(xiàn)象：第一輪篩選噬菌體滴度1.7

7、×108；第二輪1.3×109；第三輪2.3×1010。PCR擴(kuò)增得到大小約800bp的目的條帶。測(cè)序結(jié)果顯示插入片段長(zhǎng)度為768bp。Ig Blast序列比對(duì)顯示單鏈抗體基因由重鏈基因IgHV1(分?jǐn)?shù)438比特，E值e-124)和輕鏈IgLV2(分?jǐn)?shù)400比特，E值e-113)構(gòu)成。Geno3D以2GKI蛋白構(gòu)象為模板成功預(yù)測(cè)了單鏈抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 結(jié)論： 本部分實(shí)驗(yàn)成功篩選到表達(dá)抗CD44v6單鏈抗體重組噬菌體，并克