幽門螺桿菌促HepG2細(xì)胞增殖及其機(jī)制研究.pdf

1、目的： 探究幽門螺桿菌(Hp)是否具有促肝細(xì)胞增殖的作用，并揭示促增殖的可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究幽門螺桿菌致肝癌的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.幽門螺桿菌對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響：將不同量的幽門螺桿菌(國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637)作用于HepG2肝細(xì)胞，以同批次的同步化后未加細(xì)菌的HepG2細(xì)胞作為對(duì)照組，用CCK-8法，通過酶標(biāo)儀讀取各孔的OD值，檢測細(xì)胞的增殖情況并確定最佳的幽門螺桿菌作用劑量。 2.

2、基因芯片檢測：應(yīng)用Affymetrix人類基因表達(dá)譜芯片，檢測幽門螺桿菌促HepG2細(xì)胞增殖時(shí)細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化。 3.RT-PCR半定量技術(shù)驗(yàn)證部分基因芯片結(jié)果：將具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖濃度的幽門螺桿菌與HepG2細(xì)胞共浴24小時(shí)，提取HepG2細(xì)胞的RNA，未經(jīng)幽門螺桿菌處理的HepG2細(xì)胞作為對(duì)照組，用半定量RT-PCR的方法檢測HepG2細(xì)胞部分基因表達(dá)情況(依據(jù)基因芯片結(jié)果挑選出五對(duì)基因)，以驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果。

3、 結(jié)果： 1、幽門螺桿菌在一定的MOI比值下(0.30:1～0.075:1)，HepG2細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)。 2、基因芯片的結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞經(jīng)Hp作用后(MOI比值：0.15:1)時(shí)有19個(gè)表達(dá)上調(diào)基因，下調(diào)基因16個(gè)，其中與細(xì)胞骨架/基質(zhì)有關(guān)的上調(diào)基因6個(gè)，包括intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1)、transgelin、talin 1、tubulin、In

4、tegrin及keratin 23。DNA結(jié)合蛋白基因8個(gè)，上調(diào)4個(gè)為tubulin beta polypeptide paralog、Cell division cycle 2-like 5、myelin expression factor 2、V-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4；下調(diào)基因有4個(gè)分別為zinc finger protein 513、nucle

5、ar reccptor subfamily 1(group I，member 3)、Clock homolog、SRY(sex determining region Y)-box 5。細(xì)胞因子相關(guān)基因下調(diào)2個(gè)為interleukin 8及interleukin 1 family，member 9。 3、半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，以未加幽門螺桿菌處理的HepG2細(xì)胞作為對(duì)照組，加入幽門螺桿菌處理的HepG2細(xì)胞基因的Tubu

6、lin、ICAM、ARTS、Akeratin、ARHGDIA等轉(zhuǎn)錄水平顯著增高，經(jīng)兩樣本T檢驗(yàn)具有顯著性差別(P<0.05)，該結(jié)果與之前的基因芯片的結(jié)果相符合。 結(jié)論： 1、幽門螺桿菌在適當(dāng)?shù)腗OI比值下(0.30～0.075:1)下，對(duì)HepG2細(xì)胞具有明顯的促增殖作用。 2、基因芯片結(jié)果顯示幽門螺桿菌在促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖的過程中，HepG2細(xì)胞基因表達(dá)有明顯改變，這些異常改變的基因可能參與了幽門螺桿菌致

7、肝癌的過程。其中與細(xì)胞骨架/基質(zhì)有關(guān)的上調(diào)基因有6個(gè)。DNA結(jié)合蛋白基因上調(diào)8個(gè)，其中上調(diào)基因4個(gè)、下調(diào)基因有4個(gè)。細(xì)胞因子相關(guān)基因下調(diào)2個(gè)這些異常改變的基因可能參與了幽門螺桿菌致肝癌的過程。 3、半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，幽門螺桿菌處理組比對(duì)照組的HepG2細(xì)胞某些基因轉(zhuǎn)錄水平顯著增高。這些基因可能參與了幽門螺桿菌對(duì)細(xì)胞的促增殖過程甚至在肝癌的發(fā)生中發(fā)揮作用，通過這些基因的研究可能有助于進(jìn)一步明確幽門螺桿菌與人類肝臟疾病