黃芩配方顆粒質(zhì)量及調(diào)控HepG2細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　黃芩配方顆粒是由黃芩飲片經(jīng)過提取、濃縮、干燥等生產(chǎn)工序加糊精制粒而成的中藥顆粒，作為現(xiàn)代中藥的新形式，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和藥理作用亟待研究和完善。本研究擬建立黃芩配方顆粒的質(zhì)量檢測方法，控制其產(chǎn)品質(zhì)量;觀察黃芩配方顆粒(SBFG)對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為黃芩配方顆粒的進(jìn)一步研發(fā)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)及參考。
　　方法:
　　1.黃芩配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
　　以3批黃芩配方顆

2、粒的中試產(chǎn)品作為研究對象，從薄層色譜鑒別、含量測定等方面進(jìn)行研究，確定其質(zhì)量，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
　　1.1 定性鑒別
　　采用薄層色譜(TLC)法，對供試品的制備方法、展開溶劑、薄層板等方面分別進(jìn)行研究。
　　1.2 含量測定
　　以黃芩苷含量為指標(biāo)，采用HPLC法測定黃芩配方顆粒中黃芩苷的含量，并進(jìn)行方法學(xué)研究，最終制定黃芩配方顆粒含量測定方法及限度，作為評價黃芩配方顆粒質(zhì)量的依據(jù)。
　　2.黃芩配方顆粒調(diào)

3、控HepG2細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制研究
　　采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法，觀察不同濃度SBFG對HepG2細(xì)胞增殖的影響;Hoechst33342染色法觀察細(xì)胞凋亡情況;高內(nèi)涵分析(highcontent screening assays，HCS)技術(shù)檢測線粒體膜電位(MitochondrialMembrane Potential，MMP)、細(xì)胞色素C含量、膜通透性、核面積、核DNA含量、細(xì)胞數(shù)量的變化。
　　結(jié)果:

4、　　1.質(zhì)量研究結(jié)果
　　1.1 定性鑒別結(jié)果
　　建立了黃芩配方顆粒的薄層色譜鑒別方法。
　　1.2 含量測定結(jié)果
　　建立了HPLC法對黃芩配方顆粒中黃芩苷的含量測定方法。方法學(xué)試驗(yàn)表明，黃芩苷進(jìn)樣量在0.0898～0.4710μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為:Y=3.5326×106 X+2.9300×10，r=0.9999;黃芩苷平均加樣回收率為101.81％(n=6)，RSD為1.22％，小于2

5、.0％，表明該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)對黃芩配方顆粒中黃芩苷的含量控制。
　　2.黃芩配方顆粒對HepG2細(xì)胞增殖與凋亡的影響
　　SBFG可明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖(P＜0.01)，抑制率呈濃度依賴性，IC50值為（0.383±0.016）g/L; Hoechst33342染色可見細(xì)胞核濃染、核質(zhì)濃縮、核破碎等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化;高內(nèi)涵分析也發(fā)現(xiàn)，0.1 g/L SBFG組細(xì)胞MMP丟失以及細(xì)胞色素C釋放量明顯增

6、加(P＜0.01)，0.4 g/L SBFG進(jìn)一步顯著降低MMP、增加細(xì)胞色素C含量，并可使細(xì)胞膜通透性顯著升高(P＜0.01)、核固縮及核熒光強(qiáng)度的顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，1.6 g/L SBFG孵育細(xì)胞，除上述凋亡特征外，還伴隨著細(xì)胞數(shù)量的直接下降(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　本研究建立了黃芩配方顆粒薄層色譜鑒別方法及黃芩苷的HPLC含量測定方法;并發(fā)現(xiàn)黃芩配方顆粒SBFG可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖，促進(jìn)He