谷氨酸誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的初步探討及mGLP-1對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用.pdf

1、谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性神經(jīng)突觸的主要神經(jīng)遞質(zhì)，在維持神經(jīng)細(xì)胞正常信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要的作用。在正常情況下，谷氨酸的釋放、攝取和重吸收保持在動(dòng)態(tài)平衡中，而當(dāng)其過(guò)度釋放或攝取障礙時(shí)，谷氨酸大量積聚，腦內(nèi)濃度急劇升高，過(guò)度激活其受體從而引起一系列病理反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性壞死。研究證明，腦缺血損傷和許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如老年性癡呆、血管性癡呆等均存在谷氨酸含量過(guò)高現(xiàn)象。因此谷氨酸損傷機(jī)制的研究對(duì)于了解并治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要的意義。<

2、br>　　 已有報(bào)道神經(jīng)元的凋亡、鈣穩(wěn)態(tài)的失調(diào)和氧化應(yīng)激與谷氨酸的興奮性神經(jīng)毒作用有關(guān)。但是有關(guān)谷氨酸神經(jīng)毒性作用的機(jī)制尚未被研究透徹。入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞是一種較好的神經(jīng)元模型，它已經(jīng)被廣泛用于建立中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞模型。本文以SH-SY5Y細(xì)胞為模型研究谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性的機(jī)制。
　　 1．谷氨酸誘導(dǎo)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究MTT法檢測(cè)不同濃度的谷氨酸作用不同時(shí)間對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

3、，找到谷氨酸處理的合適的時(shí)間及合適的濃度；乳酸脫氫酶釋放量的測(cè)定檢測(cè)谷氨酸對(duì)細(xì)胞的損傷程度；DAPI染色法觀察谷氨酸處理后的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；通過(guò)以上指標(biāo)的觀察，確立谷氨酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡細(xì)胞模型。用鈣流檢測(cè)法檢測(cè)谷氨酸是否造成人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，短時(shí)間(20min)處理，谷氨酸并未引起SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高，而長(zhǎng)時(shí)間(24h)處理卻造成SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度顯著性升高，NMDA受體拮抗劑M

4、K801及代謝谷氨酸受體拮抗劑LY341495均不能阻止谷氨酸24h內(nèi)引起的SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高，且亦不能對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞起保護(hù)性作用。谷氨酸處理24h后，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽總量顯著性減少，超氧化物歧化酶活性降低，胞外丙二醛量增多，說(shuō)明谷氨酸造成SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷。
　　 2．谷氨酸對(duì)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞鈣庫(kù)調(diào)控的鈣通道功能的影響高濃度（lOmmol/L）的谷氨酸可以抑制Tg（Thapsiga

5、rgin是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca-ATP酶選擇性抑制劑，可以不可逆地使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池排空，使胞質(zhì)內(nèi)Ca濃度持續(xù)升高）誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放，進(jìn)而抑制胞外鈣離子的內(nèi)流，即抑制CCE。NMDA受體拮抗劑E801、代謝谷氨酸受體拮抗劑LY341495及電壓門(mén)控鈣離子通道拮抗劑GdCI3均不能緩解這種現(xiàn)象。
　　 3．丹參酮IIA(Tan IIA)對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用MTT法檢測(cè)不同濃度的Tan IIA24h

6、內(nèi)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的Tan IIA均能顯著性降低谷氨酸對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響；乳酸脫氫酶釋放量的測(cè)定檢測(cè)到不同濃度的Tan IIA均能顯著性降低谷氨酸對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷程度；DAPI染色法從形態(tài)學(xué)上明顯看到Tan II A對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞有保護(hù)作用；鈣流檢測(cè)法證實(shí)Tan IIA不能阻止谷氨酸24h內(nèi)引起的SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高；Tan IIA能顯著性降低谷氨酸處理24h后

7、，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽總量的減少，超氧化物歧化酶活性的降低，胞外丙二醛量的增多。
　　 4．突變重組人胰高血糖素樣肽一1(mGLP-I)對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用用cAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)到mGLP-I與天然GLP-I(nGLP-I)均能引起細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高；MTT法檢測(cè)不同濃度的mGLP-1/nGLP-124h內(nèi)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響，發(fā)現(xiàn)0.02ng/mL-lOng/mL的mGLP-I均可促SH

8、-SY5Y細(xì)胞增殖，nGLP-I對(duì)細(xì)胞存活率沒(méi)有影響；用不同濃度的mGLP-1/nGLP-1與谷氨酸同時(shí)處理細(xì)胞24h，發(fā)現(xiàn)不同濃度的mGLP-I/nGLP-I均能顯著性降低谷氨酸對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響；乳酸脫氫酶釋放量的測(cè)定檢測(cè)到不同濃度的mGLP-I/nGLP-I均能顯著性降低谷氨酸對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷程度；DAPI染色法從形態(tài)學(xué)上明顯看到mGLP-I/nGLP-1對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞有保護(hù)作用；鈣流檢測(cè)法證實(shí)mGL