HAP1通過介導胰島素分泌顆粒與KIF5B的相互作用調(diào)節(jié)胰島素分泌顆粒在胰島β細胞內(nèi)運輸.pdf

1、亨廷頓蛋白相關(guān)蛋白1（Huntingtin associated protein1，HAP1）作為一種與亨廷頓?。℉untington’s disease，HD）致病基因產(chǎn)物亨廷頓蛋白（huntingtin，htt）結(jié)合的蛋白，不僅在神經(jīng)元內(nèi)表達，也存在于包括胰島在內(nèi)的內(nèi)分泌系統(tǒng)中。在胰島內(nèi)，HAP1選擇性表達于分泌胰島素的β細胞。HAP1具有HAP1A和HAP1B兩種可變剪切體，二者在羧基末端的氨基酸序列不同，但在腦內(nèi)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的表

2、達模式基本相似。利用小分子干擾RNA（Small interfering RNA，SiRNA）沉默胰島β細胞系內(nèi)HAP1表達及敲除小鼠胰島內(nèi)HAP1的研究顯示，HAP1參與β細胞胰島素分泌即沉默或敲除HAP1后，β細胞的胰島素分泌明顯減少。但HAP1影響胰島素分泌的機制不明。
　　在神經(jīng)元內(nèi)，HAP1可作為連接微管馬達蛋白與被轉(zhuǎn)運物的銜接蛋白或相關(guān)蛋白，參與轉(zhuǎn)運物在細胞內(nèi)的運輸。HAP1尤其是HAP1A可通過與驅(qū)動蛋白輕鏈(KLC

3、)和重鏈(KHC)、動力蛋白激活蛋白(dynactin，動力蛋白的輔助因子)復合物的亞單位P150Glued(一種介導動力蛋白激活蛋白與微管結(jié)合的蛋白質(zhì))等微管馬達蛋白及相關(guān)蛋白的相互作用參與或調(diào)控神經(jīng)元內(nèi)小泡、神經(jīng)營養(yǎng)因子、受體蛋白等成份基于微管的胞內(nèi)運輸。細胞內(nèi)物質(zhì)運輸分為依賴微絲或肌動蛋白絲的運輸和依賴微管的運輸。對內(nèi)分泌細胞分泌顆粒而言，微絲依賴性運輸主要與突觸小泡/分泌顆粒短距離運輸如從儲存池向細胞膜上的募集有關(guān)，主要影響胰島

4、素的第Ⅰ相分泌；微管依賴性運輸主要與分泌顆粒的長距離運輸(包括從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基復合體、從高爾基復合體向儲存池的運輸)有關(guān)，主要影響胰島素的第Ⅱ相分泌。HAP1是否參與調(diào)節(jié)胰島素分泌顆粒的運輸而影響胰島素的分泌，目前未見報道。胰島素分泌顆粒Ⅱ相的微管依賴性運輸由驅(qū)動蛋白的KHC（又稱KIF5）介導，在鼠類，KIF5有KIF5A、KIF5B、KIF5C三種形式，而KIF5A和KIF5B分別是人類的神經(jīng)元和廣泛分布KHC的同型物，KIF5B在

5、胰腺β細胞中高表達。因此胰島素第Ⅱ相分泌顆粒運輸主要由 KIF5B介導。但HAP1是否通過介導胰島素分泌顆粒與其馬達蛋白的相互作用而調(diào)節(jié)胰島素分泌顆粒在胞內(nèi)的運輸也未見報道。
　　為了明確HAP1是否通過影響胰島素或其分泌顆粒的胞內(nèi)運輸調(diào)節(jié)胰島素的分泌，本研究在大鼠胰島β細胞瘤細胞系INS-1細胞中，觀察了沉默HAP1對胰島素分泌顆粒胞內(nèi)運輸?shù)挠绊?，并分析HAP1表達水平對胰島素分泌顆粒及其運輸所依賴的驅(qū)動蛋白KIF5B之間相互作

6、用的影響。
　　一、HAP1表達水平影響高糖刺激所致的胰島素或其分泌顆粒在INS-1細胞周邊的定位
　　為了證明HAP1通過參與胰島素或其分泌顆粒的胞內(nèi)運輸而影響胰島素的分泌，首先觀察低表達HAP1是否影響高糖刺激所致的胰島素或其分泌顆粒在INS-1細胞的周邊的定位，結(jié)果表明，沉默INS-1細胞內(nèi)HAP1后，能顯著減少高糖刺激引起的胰島素或其分泌顆粒在細胞周邊的分布。
　　1.沉默HAP1使定位在INS-1細胞胞質(zhì)周邊

7、的胰島素減少將INS-1細胞轉(zhuǎn)染HAP1 SiRNA后，用含葡萄糖3 mmol/L的林二氏重碳酸鹽緩沖液（Krebs-Ringer-Hepes–bicarbonate buffer KRHB）孵育2 h，再用含30 mmol/L葡萄糖的KRHB刺激1 h，固定細胞后免疫熒光標記胰島素并在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察胰島素分布的情況。與轉(zhuǎn)染SiRNA對照質(zhì)粒的INS-1細胞比較，沉默HAP1使胰島素彌散性分布在細胞內(nèi)而在近細胞膜的周邊胞質(zhì)部

8、位明顯減少。由于改變HAP1的表達水平并不影響胰島素的表達，因此，沉默HAP1減少細胞周邊部位的胰島素可能是胰島素向周邊的運輸減少所致。
　　2.沉默HAP1減少胰島素分泌顆粒在細胞周邊的定位胰島素是由胰島素分泌顆粒運輸至細胞膜處并胞吐到細胞外。為了分析HAP1是否影響胰島素分泌顆粒的胞內(nèi)運輸，在INS-1細胞中分別轉(zhuǎn)染HAP1 SiRNA和對照質(zhì)粒，48 h后用含3 mmol/L葡萄糖的KRH緩沖液培養(yǎng)2 h再用含30 mmol

9、/L KRH緩沖液刺激1 h。對胰島素分泌顆粒特征性膜蛋白phogrin的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞中，phogrin免疫熒光標記信號在近細胞膜的胞質(zhì)部位分布較多，而在轉(zhuǎn)染HAP1 SiRNA的細胞中，phogrin陽性信號分布較彌散，在近細胞膜的周邊部胞質(zhì)內(nèi)定位明顯減少。在轉(zhuǎn)染表達phogrin-EGFP的INS-1細胞內(nèi)，沉默HAP1使phogrin-EGFP成團分布于近核胞質(zhì)內(nèi)，近細胞膜的周邊部分布較轉(zhuǎn)染對照SiRNA

10、質(zhì)粒的細胞明顯減少。而RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測顯示，沉默HAP1不改變phogrin的表達。由此進一步證明，沉默HAP1可使胰島素分泌顆粒向細胞膜周邊的運輸減少。
　　二、HAP1表達水平影響INS-1細胞中分泌顆粒運輸速度
　　為了為HAP1參與胰島β細胞內(nèi)分泌顆粒運輸提供直接證據(jù)，進一步檢測了HAP1表達水平對INS-1細胞中分泌顆粒運輸速度的影響，觀察到沉默HAP1可顯著抑制INS-1細胞中分泌顆

11、粒的運輸。
　　1.沉默HAP1降低胰島素分泌顆粒胞內(nèi)運輸速度將HAP1 SiRNA質(zhì)?；蚱鋵φ辗謩e與pEGFP-phogrin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染INS-1細胞后，在激光掃錨共聚焦顯微鏡下用熒光漂白后恢復（fluoscence recovery after photographbleach，F(xiàn)RAP）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在沉默HAP1的INS-1細胞內(nèi)，漂白后的EGFP-phogrin熒光強度恢復速度較對照細胞明顯減慢，即EGFP-phogri

12、n標記的胰島素分泌顆粒在細胞內(nèi)的運輸速度明顯降低。
　　2.降低HAP1表達抑制轉(zhuǎn)染表達的皰疹性口腔炎病毒糖蛋白在INS-1細胞中的運輸速度重組表達的皰疹性口腔炎病毒糖蛋白（vesicular stomatitis viralglycoprotein，VSVG）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成后，當溫度為40℃時便可逆性錯誤折疊并滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，而當溫度降為32℃時，則恢復正常折疊并移出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以微管依賴性運輸方式移向細胞膜或近細胞膜的周邊胞質(zhì)。本

13、研究中，當把表達VSVG-EGFP融合蛋白的質(zhì)粒與HAP1 SiRNA質(zhì)?；蚱鋵φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染INS-1細胞后，應用激光掃描共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察比較沉默HAP1對VSVG-EGFP溫度敏感的微管依賴性運輸速度的影響。結(jié)果顯示，在40℃培養(yǎng)時，兩組細胞內(nèi)的VSVG-EGFP均呈聚集狀滯留于近細胞核胞質(zhì)；當把培養(yǎng)溫度降為32℃培養(yǎng)3 h后，轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞內(nèi)近核處的聚集狀VSVG-EGFP減少，而在細胞膜上或近細胞膜周邊胞質(zhì)彌散狀VSVG-

14、EGFP增加，但在HAP1沉默組細胞，VSVG-EGFP仍主要呈聚集狀滯留于核周胞質(zhì)；32℃培養(yǎng)5 h后，轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞內(nèi)近核處的聚集狀VSVG-EGFP進一步減少，細胞膜上或近細胞膜周邊胞質(zhì)彌散狀VSVG-EGFP進一步增加，而HAP1沉默組細胞內(nèi)VSVG-EGFP仍主要呈滯留于細胞核周胞質(zhì)內(nèi)，細胞膜上或細胞周邊部仍然極少有彌散VSVG-EGFP。由此證明HAP1參與胰島β細胞中分泌顆粒的微管依賴性運輸。
　　三、HAP1介

15、導INS-1細胞內(nèi)胰島素分泌顆粒與微管馬達蛋白KIF5B的相互作用KIF5B介導鼠類胰島β細胞內(nèi)胰島素或其分泌顆粒的微管依賴性運輸。為了明確HAP1是否作為胰島素分泌顆粒與KIF5B之間的銜接蛋白或相關(guān)蛋白參與胰島素分泌顆粒的運輸，繼而對HAP1、胰島素分泌顆粒和KIF5B之間相互作用進行了分析。對野生型INS-1細胞進行免疫共沉淀分析顯示，HAP1既能與phogrin結(jié)合，也能與KIF5B結(jié)合，KIF5B還能與phogrin結(jié)合，表明

16、HAP1、phogrin和KIF5B三者之間均存在相互作用。當把INS-1細胞轉(zhuǎn)染HAP1SiRNA質(zhì)粒或其對照質(zhì)粒后再進行免疫共沉淀分析，發(fā)現(xiàn)沉默HAP1后phogrin與KIF5B的結(jié)合減少，即沉默HAP1能顯著抑制phogrin與KIF5B之間的相互作用。
　　結(jié)論：HAP1參與胰島β細胞中胰島素或其分泌顆粒的胞內(nèi)微管依賴性運輸，HAP1與胰島素分泌顆粒和其基于運輸?shù)奈⒐荞R達蛋白KIF5B之間相互作用。HAP1介導胰島素分泌