幽門螺桿菌和甲型流感病毒特異性CD4+T細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答研究.pdf

1、研究背景
　　目前,由致病微生物引起的感染性疾病仍然屬于危害人類生命的主要?dú)⑹?。宿主抗感染免疫?yīng)答是決定感染性疾病發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素。獲得性免疫應(yīng)答是宿主抵抗致病微生物再次感染的關(guān)鍵,也是疫苗發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮中樞作用:首先,其能促進(jìn)B細(xì)胞分化成熟并產(chǎn)生抗體,輔助抗體類型的轉(zhuǎn)換;其次,能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖并輔助記憶CD8+T細(xì)胞的形成;還能分泌多種細(xì)胞因子直接干擾病毒的復(fù)制,或通過(guò)招募

2、其他免疫細(xì)胞到達(dá)感染部位間接對(duì)病原體進(jìn)行清除,甚至可以像CD8+T細(xì)胞那樣介導(dǎo)對(duì)病毒感染靶細(xì)胞的直接殺傷。
　　CD4+T細(xì)胞應(yīng)答具有抗原特異性、HLA限制性和免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答等特性。CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的抗原特異性是指其只能識(shí)別由13-20個(gè)氨基酸組成的表位,而不是整個(gè)抗原或整個(gè)病原體,使得同一病原體或蛋白抗原誘導(dǎo)的CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答在表位水平具有不同的特異性。CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的HLA限制性是指:不同HLA分子通過(guò)遞呈不同的表位而

3、誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的表位特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答,使得不同個(gè)體之間因HLA分子的差異產(chǎn)生不同表位特異性應(yīng)答。免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答即,在針對(duì)復(fù)雜病原體時(shí),由于HLA的共顯性特征,同一個(gè)體中的不同 HLA分子能同時(shí)遞呈多個(gè)抗原表位誘導(dǎo)產(chǎn)生不同表位特異性應(yīng)答,各應(yīng)答之間相互抑制,產(chǎn)生強(qiáng)弱差異,使得主要的應(yīng)答僅僅聚焦于少數(shù)表位,形成優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。優(yōu)勢(shì)應(yīng)答能發(fā)揮更強(qiáng)的抗感染免疫作用,但病原體可通過(guò)突變優(yōu)勢(shì)應(yīng)答表位逃避殺傷。因此,研究CD4+T細(xì)胞抗原特異性、HLA

4、限制性以及免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答特征對(duì)揭示機(jī)體的抗感染免疫機(jī)制,研發(fā)有效疫苗等具有重要意義。
　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H. pylori)是定植于人胃粘膜的重要致病菌,是胃炎、胃潰瘍等胃部疾病的主要致病因素,與胃癌、粘膜相關(guān)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān),目前我國(guó)每年因胃癌死亡人數(shù)高達(dá)20萬(wàn)人。甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是一種能夠?qū)е氯祟惣皠?dòng)物罹患流行性感冒的RNA病毒,其每年會(huì)造成全球

5、約50萬(wàn)人的死亡,且常在世界范圍內(nèi)周期性大流行。研究證實(shí),CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在宿主抵抗H. pylori和IAV感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答中至關(guān)重要。但其抗原特異性、HLA限制性及免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答特征研究甚少,有待深入系統(tǒng)的研究。
　　研究目的
　　1.利用H. pylori與IAV自然感染人體外周血中的記憶細(xì)胞,建立H. pylori與IAV抗原特異性CD4+ T細(xì)胞系,觀察其效應(yīng)分子表達(dá)情況,探討其在抗H. pylori與IAV感

6、染免疫中的可能作用;
　　2.篩選鑒定H. pylori與IAV抗原特異性CD4+T細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答抗原及表位,比對(duì)表位序列保守性,評(píng)價(jià)其在H. pylori與IAV疫苗設(shè)計(jì)中的可能應(yīng)用;
　　3.明確H. pylori與IAV不同表位特異性優(yōu)勢(shì)CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答的HLA限制性,發(fā)掘H. pylori與IAV抗原特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在含有相同或者不同HLA基因型個(gè)體中的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答特征及規(guī)律;
　　4.分析H. pyl

7、ori感染不同個(gè)體的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答頻率及其與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性,揭示優(yōu)勢(shì)應(yīng)答對(duì)H. pylori感染導(dǎo)致不同類型胃病發(fā)生與轉(zhuǎn)歸的作用和機(jī)制;
　　研究方法
　　1. H. pylori粘附素A亞單位(H. pylori adhesion A subunit,HpaA)抗原特異性CD4+T細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答特性研究
　　利用13C呼氣試驗(yàn)、血清抗H. pylori抗體ELISA法及尿素酶試紙法篩選H

8、. pylori感染者;利用重組HpaA蛋白體外刺激H. pylori感染者PBMC擴(kuò)增建立HpaA特異性CD4+T細(xì)胞系;通過(guò)ICS技術(shù)對(duì)HpaA特異性CD4+T細(xì)胞效應(yīng)分子表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè);利用步移重疊合成肽對(duì)優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行篩選鑒定;利用PCR-SBT法對(duì)HLA進(jìn)行基因分型;利用抗體阻斷和 BLCL表位遞呈實(shí)驗(yàn)對(duì)表位HLA限制性進(jìn)行鑒定;通過(guò)體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞及BLCL對(duì)表位的自然加工遞呈特征進(jìn)行鑒定;通過(guò)MACS技術(shù)

9、及ELISPOT技術(shù)對(duì)優(yōu)勢(shì)表位特異性CD4+T細(xì)胞的記憶表型及離體頻率進(jìn)行檢測(cè);通過(guò)比較多個(gè)HLA-DRB1*1501陽(yáng)性個(gè)體的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答譜系對(duì)優(yōu)勢(shì)應(yīng)答規(guī)律進(jìn)行分析;通過(guò)分析H. pylori感染所致慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等疾病個(gè)體之間優(yōu)勢(shì)CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答頻率的差異,揭示優(yōu)勢(shì)應(yīng)答對(duì)H. pylori感染導(dǎo)致不同類型胃病發(fā)生與轉(zhuǎn)歸的作用和機(jī)制。
　　2. IAV抗原特異性CD4+T細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答特性研究
　　利用IAV

10、感染P815細(xì)胞裂解物全抗原體外刺激擴(kuò)增建立IAV特異性CD4+T細(xì)胞系;通過(guò)重組痘病毒感染P815細(xì)胞裂解物制作的IAV單個(gè)抗原對(duì)免疫優(yōu)勢(shì)蛋白抗原進(jìn)行篩選;利用步移重疊合成肽對(duì)優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行鑒定;利用PCR-SBT基因分型、抗體阻斷和BLCL表位遞呈實(shí)驗(yàn)對(duì)表位HLA限制性進(jìn)行鑒定;利用ICS技術(shù)對(duì)IAV表位特異性CD4+ T細(xì)胞效應(yīng)分子表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè);利用多序列比對(duì)對(duì)表位序列保守性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　主要結(jié)果
　　1. Hp

11、aA抗原特異性CD4+T細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答特性研究
　　1.1成功創(chuàng)立HpaA特異性CD4+T細(xì)胞系培養(yǎng)方法。該方法能從H. pylori感染陽(yáng)性者PBMC特異性擴(kuò)增出HpaA特異性CD4+T細(xì)胞系,而H. pylori感染陰性者PBMC不能擴(kuò)增出HpaA特異性CD4+T細(xì)胞系。
　　1.2研究發(fā)現(xiàn)HpaA特異性CD4+ T細(xì)胞系主要分泌IFN-γ,不分泌IL-4、IL-10和IL-17A,屬于Th1型CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。

12、r>　　1.3首次篩選鑒定出HpaA192-204,HpaA88-100和HpaA200-212三個(gè)H. pylori抗原的功能性免疫優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位。
　　1.4研究確定了HpaA192-204、HpaA88-100和HpaA200-212三個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的HLA限制性分別是DRB1*0406、DRB1*1501和DQB1*0301。
　　1.5研究證實(shí)了上述優(yōu)勢(shì)表位特異性CD4+T細(xì)胞具有記

13、憶表型,且體外擴(kuò)增過(guò)程不會(huì)改變免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答譜系。
　　1.6研究證實(shí)了上述優(yōu)勢(shì)表位均能夠被抗原遞呈細(xì)胞自然加工遞呈,且部分表位氨基酸序列在H. pylori不同菌株之間高度保守,可作為H. pylori表位疫苗的候選抗原。
　　1.7從1115例胃部疾病患者篩選出59例HLA-DRB1*1501陽(yáng)性的H. pylori感染患者,研究發(fā)現(xiàn)HpaA88-100特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在攜帶HLA-DRB1*1501基因的H. p

14、ylori感染陽(yáng)性個(gè)體中處于免疫優(yōu)勢(shì)地位。
　　1.8首次證實(shí)HLA-DRB1*1501介導(dǎo)的HpaA88-100特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答頻率與H. pylori感染所致慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等胃部疾病的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示HLA-DRB1*1501對(duì)胃部疾病的保護(hù)作用是通過(guò)介導(dǎo)優(yōu)勢(shì)CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答來(lái)實(shí)現(xiàn)的,也表明HpaA88-100為H. pylori特異的保護(hù)性表位。
　　2. IAV抗原特異性CD4+T細(xì)

15、胞免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答特性研究
　　2.1成功制備出可溶性IAV感染P815細(xì)胞全抗原,并以此成功創(chuàng)立IAV全抗原特異性CD4+T細(xì)胞系培養(yǎng)方法。
　　2.2研究發(fā)現(xiàn)IAV全抗原特異性CD4+T細(xì)胞系主要分泌分泌IFN-γ和TNF-α,不分泌IL-2,但上調(diào)表達(dá)CD107分子。表明IAV抗原特異性CD4+T細(xì)胞主要通過(guò)IFN-γ和TNF-α直接干擾病毒復(fù)制和直接的細(xì)胞毒性作用介導(dǎo)抗病毒保護(hù)性免疫。
　　2.3成功制備出可溶性I

16、AV單個(gè)抗原,研究證實(shí)了M1與NP是IAV特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)勢(shì)抗原靶標(biāo)。
　　2.4篩選鑒定出M1129-141、M1209-221、NP404-416和NP463-475等四個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)IAV特異性CD4+T細(xì)胞表位以及M143-55、M194-106、M1103-115、M1105-117、NP102-114和NP115-127等六個(gè)亞優(yōu)勢(shì)IAV特異性CD4+T細(xì)胞表位。
　　2.5研究明確了M1129-141、

17、M1209-221、NP404-416和NP463-475四個(gè)免疫優(yōu)勢(shì) IAV特異性 CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答的 HLA限制性分別是 DRB1*0101、DPB1*0301、DRB1*0404和DRB1*0901;M143-55、M194-106、M1103-115、M1105-117、NP102-114和 NP115-127等六個(gè)亞優(yōu)勢(shì) IAV特異性 CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答的 HLA限制性分別是DRB1*0701、DRB1*1302、DRB

18、1*0404、DRB1*0901、DPB1*0101和DPB1*0601。
　　2.6研究發(fā)現(xiàn)在新流行的IAV菌株中存在著大量表位突變體,且免疫優(yōu)勢(shì)表位的突變頻率大于亞優(yōu)勢(shì)表位,表明優(yōu)勢(shì)表位比亞優(yōu)勢(shì)表位面臨著更大的選擇壓力。
　　研究意義
　　1.本課題創(chuàng)立了利用H. pylori自然感染個(gè)體PBMC體外擴(kuò)增培養(yǎng)建立HpaA抗原特異性CD4+T細(xì)胞系的方法。篩選鑒定了H. pylori第一個(gè)HLA限制的并具有免疫原性的

19、CD4+T細(xì)胞表位。首次對(duì)H. pylori保護(hù)性抗原HpaA特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的免疫優(yōu)勢(shì)特性進(jìn)行了系統(tǒng)性分析。并證實(shí)HLA-DRB1*1501介導(dǎo)的HpaA88-100特異性優(yōu)勢(shì)CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答對(duì)H. pylori所致慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌等疾病具有保護(hù)性作用。為H. pylori保護(hù)性抗原免疫優(yōu)勢(shì)表位的篩選鑒定提供了新的方法,為深入理解抗原特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在H. pylori感染免疫中的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答特性及其對(duì)H.

20、pylori感染導(dǎo)致不同類型胃病發(fā)生與轉(zhuǎn)歸的作用和機(jī)制提供新的認(rèn)識(shí),也為 H. pylori新型疫苗設(shè)計(jì)提供了新的候選抗原。
　　2.本課題利用IAV感染P815細(xì)胞制作的可溶性IAV全抗原創(chuàng)立了IAV多克隆抗原特異性CD4+T細(xì)胞系的培養(yǎng)方法。首次從IAV全基因組蛋白水平明確了IAV抗原特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答所聚焦的優(yōu)勢(shì)抗原靶標(biāo)是M1與NP。篩選鑒定了若干M1與NP來(lái)源的新的免疫優(yōu)勢(shì)及亞優(yōu)勢(shì)CD4+T細(xì)胞表位。系統(tǒng)分析比較了優(yōu)