幽門螺桿菌外膜蛋白Omp18與UreB414融合疫苗的實驗研究.pdf

1、目的： 幽門螺桿菌(H.pylori)的全球感染率超過了50％，它是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與腸型胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)?，F(xiàn)有的根除H.pylori的手段主要是聯(lián)合應(yīng)用抗生素，但由于該菌感染的普遍性、耐藥菌株的不斷增加、較高的花費以及病人的低依從性等，限制了抗菌藥物的療效。因此，接種簡便、成本低廉并易于大面積推廣的H.pylori疫苗的研究十分迫切。 在疫苗研究中，篩選有

2、效的免疫抗原是關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)。目前大多數(shù)疫苗采用的是與Hp致病相關(guān)的毒力因子作為抗原成分，如尿素酶(urease)、熱休克蛋白(heatshockprotein，Hsp)、空泡毒素(vacuolatingcytotoxin，VacA)、細胞毒素相關(guān)抗原(cytotoxinassociateantigen,CagA)、中性粒細胞激活蛋白(neutrophil-activatingprotein，NAP)等。革蘭氏陰性細菌外膜蛋白具有良好的抗

3、原活性，這些外膜蛋白作為抗體和免疫細胞攻擊的主要靶標，可以介導(dǎo)對細菌最直接有效的殺滅作用，是決定免疫反應(yīng)是否對人體具有保護性的關(guān)鍵因素。OMP18和UerB都是Hp的外膜蛋白成分，其編碼基因具有高度保守性，也是Hp疫苗重要的免疫抗原。但一直令學(xué)者們遺憾的是每種抗原單獨免疫動物時，獲得的保護率均不是很高，而多種抗原聯(lián)合免疫才能達到較好的效果。 因此，本研究擬對上述二種保護性抗原基因進行克隆表達，并與分子內(nèi)佐劑LTB串聯(lián)得到多亞單位

4、的融合蛋白，分別觀察在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的不同免疫應(yīng)答和保護作用，為篩選有效的H.pylori疫苗抗原奠定基礎(chǔ)。 方法： l、采用PCR方法從H.pylori臨床分離株9806基因組中擴增OMP18基因片段并構(gòu)建在原核表達載體pQE-30中，通過酶切、測序鑒定陽性重組子。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAssist和GenBank數(shù)據(jù)庫對已公布的H.pyloriOMP18基因序列進行相似性分析。將含目的基因片段的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌M1

5、5中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，用AKTA-explore純化儀純化表達的重組蛋白rOMP18。應(yīng)用Tris-Tricine方法對表達產(chǎn)物和純化產(chǎn)物進行分析，用純化的rOMP18免疫家兔，并采用Westernblot和免疫擴散試驗鑒定重組蛋白的免疫性。 2、采用重疊延伸PCR的方法，分別以UreB414活性片段做為融合蛋白前端，與OMP18及粘膜佐劑LTB依次串聯(lián)，和以粘膜佐劑LTB做為融合蛋白前端與OMP18依次串聯(lián)，在片段間引入5

6、個氨基酸的linkerPQDPP進行連接；將融合基因構(gòu)建在原核表達載體pET-28a中，經(jīng)酶切及測序鑒定后，陽性重組子轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)重組工程菌表達。Tris-Tricine電泳和免疫印跡鑒定融合蛋白，DNAssist軟件分析融合蛋白理化特性，通過純化條件摸索，AKTA-explore純化儀純化融合蛋白LTB-OMP18(LO)和UreB414-OMP18-LTB(UOL)。純化后的融合蛋白分別與G

7、Ml神經(jīng)節(jié)苷脂進行結(jié)合試驗。 3、將144只小鼠隨機分為6組：PBS對照組、單亞單位分子內(nèi)佐劑融合蛋白組(UreB414-LTB)、雙亞單位分子內(nèi)佐劑融合蛋白組(UreB414-OMP18-LTB、)單一亞單位分子內(nèi)佐劑融合蛋白組(LTB-OMP18)、體外物理混合組(rOMP18+UreB414-LTB)無分子內(nèi)佐劑單一亞單位蛋白組(OMP18)。分別于0、7、14、28天口服免疫，劑量為150μg/只/次。末次免疫后10天，

8、每組取12只小鼠剖殺取樣，ELISA檢測口服免疫后血清特異性IgG、IgA，糞便、腸道沖洗液slgA水平。每組余下12只口服10CFUHp小鼠適應(yīng)株，30天后，取小鼠胃部標本通過Hp培養(yǎng)及特異性PCR檢測，確定Hp感染率，并計算口服免疫后各組攻毒保護率。 結(jié)果： 1、經(jīng)酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示，H.pyloriOMP18基因被正確克隆到pQE-30中。OMP18基因的核苷酸序列長度為540bp，與GenBank中序列比

9、較，同源性為99％，氨基酸序列的同源性為100％。重組工程菌IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)Tris-Tricine分析，表達的目的蛋白分子量約為20KD，其表達產(chǎn)物占菌體蛋白的20％，為包涵體形式表達，經(jīng)AKTA-explore100蛋白純化系統(tǒng)純化，純化后得到純度＞85％的目的蛋白。以純化蛋白為抗原加弗氏佐劑免疫家兔，制備兔抗rOMP18特異抗體，經(jīng)免疫雙擴散法檢測，兔抗血清抗體效價為1:32，WesternBlot結(jié)果也顯示重組蛋白能被兔抗H.p

10、ylori血清所識別。 2、經(jīng)酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了融合基因LTB-OMP18和UreB414-OMP18-LTB，將融合基因LO和UOL克隆到pET28a載體上，得到融合蛋白表達載體pLO和pUOL，DnaStra軟件評價蛋白linker具有較好的柔韌性。將兩個陽性重組子轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)后，37℃培養(yǎng)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE和免疫印跡分析顯示分子量約為31KD和43K

11、D。UVP掃描證實融合蛋白表達約占總蛋白的25％和20％。包涵體鑒定試驗證實融合蛋白主要以包涵體形式表達，確定了采用親和層析的純化方法。純化后得到純度＞85％的融合蛋白。純化后的兩個融合蛋白分別能與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，實驗證實重組融合蛋白中LTB組分具有與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的生物活性，說明融合蛋白保持了LTB的天然活性，具有粘膜佐劑活性。 3、ELISA檢測融合蛋白rLO和rUOL免疫小鼠后血清特異性IgG、IgA，

12、糞便、腸道沖洗液sIgA水平與PBS組相比，升高明顯，差異極顯著(p＜0.001)，與亞單位免疫組相比，差異顯著(p＜0.05)，與多亞單位蛋白物理混合組相比，差異不顯著(p＞0.05)。免疫攻毒后，免疫保護率為：rLO組67％(8/12)，rUOL組83％(10/12)。統(tǒng)計分析顯示，多亞單位融合蛋白組免疫保護率與PBS組相比，差異極顯著(p＜0.001)，與rOMP18組相比，差異顯著(p＜0.05)，與rOMP18+UreB414

13、-LTB組相比，差異不顯差(p＞0.05)。 結(jié)論： 1、成功克隆了H.pyloriOMP18基因，與GenBank已公布的H.pylori菌株基因序列具有高度同源性。純化的重組蛋白rOMP18，具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可以作為H.pylori基因工程疫苗候選抗原。 2、成功構(gòu)建、表達融合蛋白rLO和rUOL，純化后的融合蛋白保持各亞單位組分及佐劑的獨立免疫反應(yīng)性，融合基因間的Linker對融合蛋白的立體