豬胸膜肺炎放線桿菌apxⅡ基因工程突變株構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一種豬傳染性呼吸道疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防和控制該病的主要措施是疫苗免疫接種。 目前商品化的全菌滅活疫苗和亞單位疫苗能夠減輕同源血清型菌感染豬引起的臨床癥狀并降低死亡率，但不能降低發(fā)病率、慢性感染和阻止肺部病變，對異源血清

2、型菌的感染也不能提供完全的交叉保護(hù)?？梢哉f，目前采用滅活苗和亞單位疫苗免疫不是最好的選擇，迫切需要更安全、高效的新型疫苗來預(yù)防和控制該傳染病的發(fā)生與流行。 與滅活疫苗和亞單位疫苗不同，自然感染或試驗(yàn)感染能夠誘導(dǎo)抗任何異源血清型的保護(hù)。這樣，弱毒活疫苗也許是解決當(dāng)前商品化疫苗不足的一種可行方法。構(gòu)建胸膜肺炎放線桿菌突變株的傳統(tǒng)方法存在很多缺陷。如利用化學(xué)或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的突變方法存在隨機(jī)性，只適合于表型發(fā)生明顯變化突變子的篩選，而不導(dǎo)

3、致明顯表型變化的突變株就不能夠通過這些方法獲得；而通過同源重組導(dǎo)致靶基因突變方法獲得的突變株最后含有抗性標(biāo)記，由于不符合生物安全性要求不能作為疫苗株用于疫苗生產(chǎn)。鑒于上述背景，本研究通過使用同源重組技術(shù)和負(fù)向選擇方法(counterselectionstrategy)構(gòu)建了不含抗性標(biāo)記的豬胸膜肺炎放線桿菌毒素apxⅡ基因工程突變株，隨后對其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，主要研究內(nèi)容包括：1.外膜脂蛋白(omlA)基因啟動子序列驗(yàn)證及作為啟動子啟

4、動綠色熒光蛋白(GFP)基因的功能特性研究由于胸膜肺炎放線桿菌血清1型(S4074)外膜脂蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)已經(jīng)得到證實(shí)，本研究以APP血清1型基因組DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增157bpomlA基因啟動子序列，序列測定證實(shí)無誤后以正向的方式將其連接到不帶啟動子的綠色熒光蛋白基因(GFP)上游，構(gòu)建質(zhì)粒pMSKOGFP。通過電穿孔將質(zhì)粒pMSKOGFP電轉(zhuǎn)化到APP，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化子發(fā)熒光的情況。結(jié)果含有質(zhì)粒pMSKOGFP的

5、APP轉(zhuǎn)化子能夠表達(dá)GFP，表明157bpomlA基因啟動子序列能夠啟動GFP基因在APP中表達(dá)。 2.sacB基因在APP中表達(dá)特性研究枯草桿菌sacB基因編碼果聚糖蔗糖酶，表達(dá)sacB基因的革蘭氏陰性細(xì)菌在含有5％蔗糖的培養(yǎng)基上不能生長。為了描述sacB基因在胸膜肺炎放線桿菌的表達(dá)特性，本研究采用PCR從質(zhì)粒PGS284中擴(kuò)增sacB基因，將它按照omlA基因啟動子序列相同的方向克隆到質(zhì)粒pMSK-omlA中獲得重組質(zhì)粒pM

6、SKOS。同時，將單獨(dú)sacB基因連接到經(jīng)改造的pBluescriptsⅡsk(+)得到重組質(zhì)粒pMSKS。重組質(zhì)粒pMSKOS和pMSKS分別電穿孔轉(zhuǎn)化APPHB株血清7型菌中，在5％蔗糖平板分析APP轉(zhuǎn)化子對蔗糖的敏感性。結(jié)果攜帶質(zhì)粒pMSKS的APP轉(zhuǎn)化子在5％蔗糖溶液瓊脂平板能夠很好的生長，而攜帶質(zhì)粒pMSKOS的轉(zhuǎn)化子生長受到抑制，表明在157bpomlA基因啟動子序列啟動作用下sacB基因表達(dá)后可以引起胸膜肺炎放線桿菌的死亡

7、。因此，對于利用負(fù)向選擇方法篩選胸膜肺炎放線桿菌基因工程突變株，sacB基因可以作為負(fù)向選擇標(biāo)記。 3.apxⅡCA基因的克隆與序列測定胸膜肺炎放線桿菌毒素apxⅡCA基因由激活基因apxⅡC和結(jié)構(gòu)毒素基因apxⅡA組成，apxⅡC基因失活后突變株的毒力大大降低，但并不影響結(jié)構(gòu)毒素蛋白ApxⅡA的分泌表達(dá)。本研究采用PCR從本室分離鑒定的APPHB野毒株血清7型基因組DNA中擴(kuò)增最主要的毒素蛋白編碼基因apxⅡCA并進(jìn)行序列測定

8、，經(jīng)BLAST比較，與國外APP血清1、2、3和7型菌株apxⅡCA基因在核苷酸上同源性達(dá)99％以上。 4.重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSK-xⅡCA-/GSA+構(gòu)建本研究首先擴(kuò)增apxⅡCA基因，PstⅠ酶切消化后連接到質(zhì)粒pBluescriptsⅡsk(+)形成重組質(zhì)粒pSK-apxⅡCA。PCR從質(zhì)粒pGFP-2擴(kuò)增GFP基因插入到apxⅡC基因特異性XbaⅠ位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pSK-XⅡCA-/GFP+。進(jìn)一步將157bpomlA啟動

9、子序列、Ampr(Ampicillinresistancegene)基因、不帶啟動子的sacB基因同時在質(zhì)粒pBluescriptsⅡsk(+)中連接形成omlA-sacB-Ampr表達(dá)盒。表達(dá)盒連接到重組質(zhì)粒pSK-XⅡCA-/GFP+中獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，命名為pSK-xⅡCA-/GSA+。由于在重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSK-xⅡCA-/GSA+中含有一個可以被外援基因替換的GFP基因和一個可方便負(fù)向選擇的omlA-sacB-Ampr表達(dá)盒，為

10、以胸膜肺炎放線桿菌作為載體構(gòu)建雙價或多價基因工程疫苗提供了十分方便的工具。 5.基因工程突變株HBC-/GFP+的篩選與鑒定采用電轉(zhuǎn)化將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSK-xⅡCA-/GSA+轉(zhuǎn)化APP血清7型菌。首先在氨芐抗性(Ampr)平板上篩選Ampr菌落，通過在5％蔗糖瓊脂平板證實(shí)這些Ampr菌落對蔗糖的敏感性。從所有被證實(shí)氨芐抗性、蔗糖敏感(Ampr、Sucs)菌落中隨機(jī)挑取3個，接種于無氨芐青霉素的TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)，以便進(jìn)一步促進(jìn)同

11、源重組。過夜培養(yǎng)物以大約每個平板生長100個單菌落的濃度把過夜培養(yǎng)液涂布僅僅含5％蔗糖的TSA瓊脂平板，將篩選的蔗糖抗性菌落(SucI)同時轉(zhuǎn)印TSA-Sucrose和TSA-Sucrose-Ampr平板，篩選的氨芐青霉素敏感轉(zhuǎn)化子。從8個Amps、Sucr克隆子經(jīng)PCR和Southernblot鑒定到一個陽性克隆子，命名為HBC-/GFP+。PCR、Southernblot進(jìn)一步證實(shí)，突變株構(gòu)建是成功的。通過Westernblot、溶

12、血性試驗(yàn)、生長試驗(yàn)和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)對突變株的一些生物學(xué)特性進(jìn)行研究。 6.基因工程突變株HBC-GFP+對Balb/C小鼠和仔豬的安全性研究以親本菌株為對照，分別用多個不同濃度的基因工程突變株(HBC-/GFP+)菌液通過腹腔注射Balb/C小鼠。結(jié)果基因工程突變株HBC-/GFP+以2×108CFU，1×109CFU，2×109CFU濃度注射的小鼠沒有死亡，而親本菌株以2×107CFU，1×108CFU，2×108CFU濃度注

13、射的小鼠全部死亡，表明基因工程突變株HBC-/GFP+與親本菌株相比，毒力明顯降低且對小鼠是安全的。 將基因工程突變株HBC-/GFP+以1×108CFU和2×108CFU兩個劑量通過氣管分別注射2頭仔豬，同時設(shè)TSB培養(yǎng)基對照。結(jié)果注射后當(dāng)天，對照組仔豬未出現(xiàn)任何異?，F(xiàn)象，而基因工程突變株(HBC-/GFP+)注射的仔豬體溫略微升高，上升度數(shù)在0.3℃左右，同時出現(xiàn)呼吸頻率增加、呼吸困難、食欲下降、嗜睡等臨床癥狀，但這些癥狀僅

14、持續(xù)一天就恢復(fù)正常，表明基因工程突變株HBC-/GFP+對仔豬是安全的。 7.基因工程突變株HBC-/GFP+對Balb/C小鼠和仔豬的免疫效力研究為了評價基因工程突變株HBC-/GFP+對Balb/C小鼠的免疫效力，將基因工程突變株HBC-/GFP+(活菌含量2×108CFU)通過腹腔免疫Balb/C小鼠，間隔兩周，免疫兩次，同時設(shè)TSB和滅活疫苗作為對照。利用建立的毒素ApxⅡELISA和間接血凝試驗(yàn)對免疫小鼠進(jìn)行抗體檢測。

15、結(jié)果基因工程突變株HBC-/GFP+免疫小鼠的毒素ApxⅡ抗體和間接血凝抗體效價均高于滅活疫苗，且第二次免疫后毒素ApxⅡ抗體和間接血凝抗體效價與第一次相比均有明顯上升。當(dāng)?shù)诙蚊庖?周后，連同TSB和滅活疫苗對照，用APP血清7型(活菌含量2×108CFU)和血清1型(活菌含量1×108CFU)對免疫小鼠進(jìn)行攻毒。結(jié)果滅活疫苗免疫小鼠對APP血清1型菌攻擊的保護(hù)率為50％(4/8)，對7型菌的保護(hù)率為75％(6/8)；而基因工程突變株

16、HBC-/GFP+免疫小鼠對1型菌攻擊的保護(hù)率為75％(6/8)，對7型菌的保護(hù)率為100％(8/8)。小鼠免疫和攻毒試驗(yàn)結(jié)果初步顯示，基因工程突變株免疫小鼠對于同源血清型和異源血清型菌攻擊的免疫保護(hù)效果均優(yōu)于滅活疫苗，具有良好的應(yīng)用前景。為了評價基因工程突變株HBC-/GFP+對仔豬的免疫效力，用基因工程突變株HBC-/GFP+(活菌含量1×109CFU)通過氣管間隔兩周免疫仔豬兩次，同時設(shè)TSB和滅活疫苗為對照。用ELISA檢測毒素

17、ApxⅡ抗體，間接血凝試驗(yàn)檢測全菌抗體。第二次免疫2周后，連同TSB和滅活疫苗對照，分別用APP血清1型(活菌含量1×109CFU)和血清7型(活菌含量2×109CFU)通過氣管對免疫仔豬進(jìn)行攻毒。第二次免疫后基因工程突變株HBC-/GFP+免疫仔豬具有較高的毒素ApxⅡ抗體和間接血凝抗體，且兩次免疫的抗體水平都比滅活疫苗抗體水平高?；蚬こ掏蛔冎闔BC-/GFP+免疫仔豬對1型菌的保護(hù)率為75％(3/4)，對7型菌的保護(hù)率為100％(

18、4/4)，而滅活疫苗免疫仔豬對1型菌的保護(hù)力為50％(2/4)，對7型菌的保護(hù)力為100％(4/4)?；蚬こ掏蛔冎闔BC-/GFP+免疫仔豬攻毒后沒有表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，剖檢肺部病變正常；滅活疫苗組仔豬攻毒后體溫升高，肺部輕微出血；TSB對照組臨床癥狀最明顯，剖檢肺部嚴(yán)重出血?？贵w檢測和攻毒結(jié)果顯示出基因工程突變株HBC-/GFP+免疫仔豬對于強(qiáng)毒APP的感染后保護(hù)效果優(yōu)于滅活疫苗組，能顯著降低臨床發(fā)病，減輕肺部病變，有望研制成弱毒