鼻咽癌的靶向性放射增敏基因治療.pdf

1、目的：構(gòu)建放射敏感的融合啟動(dòng)子E6hTERTp，觀察在不同放射劑量誘導(dǎo)下放射敏感增強(qiáng)子增強(qiáng)hTERTp（人端粒酶催化亞基啟動(dòng)子）啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄活性及對特異性的影響；并進(jìn)一步構(gòu)建含E6hTERTp以及融合UL49片段的自殺基因CD/UPRT.UL49的質(zhì)粒載體，放射干預(yù)誘導(dǎo)其在鼻咽癌CNE-2細(xì)胞表達(dá)，觀察放射條件下該自殺基因/前藥系統(tǒng)在鼻咽癌細(xì)胞中的體內(nèi)以及體外放射增敏效應(yīng)，為探索新的鼻咽癌放射基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法和結(jié)

2、果： 第一部分：放射誘導(dǎo)型增強(qiáng)子E6對hTERTp靶向性增敏效應(yīng)研究 方法：overlap PCR擴(kuò)增融合啟動(dòng)子E6hTERTp以及CD/UPRT.UL49片段?；蛑亟M技術(shù)構(gòu)建融合啟動(dòng)子E6hTERTp的報(bào)告基因載體PGL3-E6hTERTp，以EGR-1p（早期生長反應(yīng)因子1啟動(dòng)子）以及hTERTp為對照，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒與pRL-SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-2細(xì)胞以及正常人成纖維細(xì)胞（HDF），不同放射劑量

3、（0，2，6，10gy）誘導(dǎo)下通過雙熒光素酶分析系統(tǒng)檢測報(bào)告基因的表達(dá)效率，研究不同放射劑量對各啟動(dòng)子啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄活性及對其特異性的影響；構(gòu)建自殺基因載體pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49以及pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，在0gy，2Gy，6gy，10gy等不同放射條件下，半定量RT-PCR法檢驗(yàn)其轉(zhuǎn)錄活性，免疫印跡法檢測CD/UPRT.

4、UL49以及CD/UPRT蛋白表達(dá)； 結(jié)果：雙熒光素酶分析系統(tǒng)檢測顯示，正常HDF細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染PGL3-E6.hTERTp組以及PGL3-hTERTp組無論照射與否，其啟動(dòng)活性均維持在極低水平；在給予0Gy，2Gy，6Gy，以及10Gy放射干預(yù)之后，轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞的各啟動(dòng)子活性均隨放射劑量的增加而增加，其中，轉(zhuǎn)染E6.hTERTp各放射劑量組啟動(dòng)活性分別為18，8184±4.1969，102.6512±20.5879，29

5、1.7274±35.4752，407.5505±27.1526，放射組比較未放射組分別增加了5.4倍，15.2倍和21.7倍，各放射組兩兩間同樣有顯著性差異（p<0.05）。E6.hTERTp2Gy組、6Gy組以及10Gy組啟動(dòng)活性分別是hTERTp相同放射劑量組的2.4倍，3.5倍和2.8倍，兩個(gè)啟動(dòng)子組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），證實(shí)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞中，放射誘導(dǎo)型增強(qiáng)子E6能夠明顯提高h(yuǎn)TERTp放射敏感性，且不影響其

6、腫瘤特異性。 自殺基因載體pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49以及pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞后，WESTERN BLOTTING顯示檢測到的特異性蛋白條帶。RT-PCR檢測顯示所有經(jīng)照射后的實(shí)驗(yàn)組mRNA量均要顯著高于未照射組（p<0.05），其中CD/UPRT在6Gy時(shí)出現(xiàn)最高值，而CD/UPRT.UL49在6Gy和10Gy處理下，mRNA量沒有顯著

7、差別（p>0.05），但均高于0Gy，2Gy時(shí)mRNA轉(zhuǎn)錄量（p<0.05）；證實(shí)放射干預(yù)可激發(fā)融合啟動(dòng)子E6hTERTp啟動(dòng)下游自殺基因表達(dá)。 第二部分啟動(dòng)子E6hTERTp介導(dǎo)的自殺基因CD/UPRT.UL49以及CD/UPRT表達(dá)對鼻咽癌放射--基因治療增敏效應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn) 方法：自殺基因載體pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49以及pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT

8、經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，在0gy，2Gy，6gy，10gy等不同放射條件下，高效液相色譜法檢測其促進(jìn)前藥系統(tǒng)5-Fc（5-氟胞嘧啶）轉(zhuǎn)化為5-FU（5-氟尿嘧啶）的效率，MTT（四甲基偶氮唑藍(lán)）法檢測不同放射劑量下，不同濃度5-Fc對轉(zhuǎn)染自殺基因載體的的CNE-2細(xì)胞的殺傷效應(yīng)并進(jìn)行兩種不同基因治療組之間以及各基因治療組與單純放射治療組之間細(xì)胞存活率對比，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果：給予前藥5-Fc以及

9、放射干預(yù)后，高效液相色譜法檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過照射后轉(zhuǎn)染自殺基因載體pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT以及pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49載體的孔中均檢測到5-Fu，未照射孔沒有檢測到5-Fu； MTT檢測，單純前藥干預(yù)濃度為200ug/ml時(shí)，細(xì)胞生存率為93.04；轉(zhuǎn)染自殺基因載體后，前藥濃度為200（ug/ml），給予2Gy，6Gy，10Gy放射干預(yù)，CNE-2細(xì)胞存活率

10、較野生CNE-2細(xì)胞組均明顯下降（p<0.05）；放射劑量為2Gy以及10Gy時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49組比較轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（-）E6.hTERTp。CD/UPRT組放射增敏效果更明顯（p<0.05）。 第三部分前體藥物/自殺基因系統(tǒng)對鼻咽癌放射增敏的原位基因治療實(shí)驗(yàn)研究 方法：CNE-2細(xì)胞接種裸鼠皮下建立鼻咽癌動(dòng)物模型，進(jìn)行脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒DNA瘤內(nèi)注射的原位基因（i

11、n situ）治療實(shí)驗(yàn)，待腫瘤長寬徑達(dá)到0.7-1.0cm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分組，瘤內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的DNA質(zhì)粒，以及腹腔注射5-FC，并給予腫瘤局部每天3Gy照射，總劑量9Gy。記錄腫瘤體積，比較不同處理組的抑瘤效應(yīng)；病理切片證實(shí)腫塊性質(zhì)。抽提腫瘤組織RNA，RT-PCR反應(yīng)，鑒定CD/UPRT.UL49基因在腫瘤組織內(nèi)是否有表達(dá)。 結(jié)果：1×107CNE-2細(xì)胞接種裸鼠后，9天內(nèi)均順利成瘤。未經(jīng)放射的自殺基因pcDNA3.1（-

12、）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49/前藥治療組沒有明顯抑瘤效果；放射-自殺基因pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49/前藥治療組生長抑制率93.7579，優(yōu)于其他各放射組（p<0.05），而放射-自殺基因pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT/前藥治療組生長抑制率88.86427，較其放射治療對照組沒有差別（p>0.05）。病理切片檢查各放射組均出現(xiàn)嚴(yán)重壞死。 結(jié)論：E6