2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、鋅指蛋白403(zinc finger protein403,ZNF403),又稱GGNBP2(gametogenetin binding protein2),定位于人染色體17q12~17q21.1,該區(qū)位于乳腺癌,前列腺癌和喉癌等腫瘤的遺傳易感區(qū)域內(nèi),其GenBank序列號為NM_024835.3。ZNF403基因在生物物種進(jìn)化中高度保守。目前已知人類ZNF403基因含有兩種不同的RNA轉(zhuǎn)錄剪切本。其中一個截短型剪切本為本室李友軍等

2、采用RNA差異顯示法從喉癌組織中所鑒定獲得,稱喉癌相關(guān)基因1(Laryngeal Carcinomarelated gene1,LCRG1),僅含有7個外顯子,編碼一個含288個氨基酸的蛋白。以往研究顯示LCRG1在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的抑瘤作用。另一個全長轉(zhuǎn)錄本,含有14個外顯子,編碼一個含696個氨基酸的蛋白質(zhì),其編碼的蛋白目前功能尚不明確。
  因此本研究將以探討ZNF403全長轉(zhuǎn)錄本在腫瘤細(xì)胞中的生物功能為目的,以期

3、更全面的揭示該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
  本研究采用輔助依賴型腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)對ZNF403進(jìn)行全面的功能缺失型研究。首先采用Cre-loxp生產(chǎn)系統(tǒng),成功構(gòu)建生產(chǎn)了高純度高效率的HD-Ad-ZNF403-shRNA病毒干擾表達(dá)系統(tǒng),在獲得特異高效的內(nèi)源性表達(dá)沉默效果后,進(jìn)一步對ZNF403表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性分析,在體內(nèi)對細(xì)胞增殖,非停泊依賴性生長和細(xì)胞遷移活性進(jìn)行探討,并在體外對其細(xì)胞增殖影響進(jìn)

4、行了驗證。為了揭示ZNF403影響細(xì)胞增殖生長的分子機(jī)制,同時采用碘化丙碇和BrdU標(biāo)記的流式細(xì)胞分析術(shù)對ZNF403缺失在細(xì)胞周期中的影響進(jìn)行分析,并采用高通量精確的人類細(xì)胞周期RealtimePCR array,全面比較ZNF403缺失后84個關(guān)鍵細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)水平變化,并采用Western blot對部分重要基因的蛋白水平變化進(jìn)行驗證,以期明確ZNF403在細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的角色和位置。此外,本研究還對候選ZNF40

5、3基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)行了初步研究分析,成功克隆其5'-端啟動子區(qū)域,并利用缺失突變、報告基因、轉(zhuǎn)染技術(shù)對該基因啟動子區(qū)域進(jìn)行初步鑒定,同時采用TCDD藥物處理分析特殊轉(zhuǎn)錄因子AHR結(jié)合位點的調(diào)控影響。本研究首次發(fā)現(xiàn)ZNF403基因為一個新的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白,抑制ZNF403的表達(dá)能通過阻滯細(xì)胞周期的S期和G2/M檢測點,顯著抑制腫瘤的增殖,為腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了有價值的線索。
  [ZNF403基因結(jié)構(gòu),同源性分析及在

6、腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)檢測]
  ZNF403基因定位于腫瘤相關(guān)的遺傳易感區(qū)17q12~17q21.1.區(qū)域內(nèi),該基因的全長轉(zhuǎn)錄本為2869 bp,含有14個外顯子,編碼序列(CDS)位置為317-2410,編碼一個包含696個氨基酸的蛋白質(zhì)(蛋白序列登錄號:Q9H3C7.1)。由于剪接方式不同目前已知形成至少2種mRNA剪接變異體,編碼至少2種不同的蛋白質(zhì)。除全長轉(zhuǎn)錄本ZNF403外,其剪切異構(gòu)轉(zhuǎn)錄本LCRG1的全長為3448bp,

7、包括7個外顯子,編碼一個由288個氨基酸組成的蛋白。利用比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人ZNF403基因在黑猩猩、獼猴、狗、牛及小鼠等多種動物中高度同源,提示該基因在進(jìn)化中的的高度保守性。本研究采用特異性引物在不同細(xì)胞株中分別對ZNF403和LCRG1的表達(dá)進(jìn)行Real timePCR檢測,結(jié)果顯示ZNF403的表達(dá)水平比LCRG1高大約10倍,而Western Blot方法僅能檢測到ZNF403蛋白的表達(dá),以上結(jié)果說明ZNF403為該基因的主要

8、轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)物。
  [輔助依賴型腺病毒介導(dǎo)的人類ZNF403基因RNA干擾系統(tǒng)的設(shè)計,構(gòu)建和鑒定]
  采用基于RNA聚合酶Ⅲ,鼠源性U6啟動子的DNA載體構(gòu)建表達(dá)shRNA。特異性針對ZNF403的目標(biāo)序列如下:5'-GGGCAAATTCTGAAGAGAACGACA-3'。采用兩對互補(bǔ)的DNAoligos構(gòu)建一個含有U6 promoter和ZNF403 shRNA的輔助依賴型腺病毒(HD-Ad vector)質(zhì)粒形式載體H

9、D-Ad-ZNF403-shRNA。然后經(jīng)PmeI酶切該質(zhì)粒載體,暴露病毒末端倒置重復(fù)序列,再與輔助性病毒的共同感染116細(xì)胞,采用Cre/loxP系統(tǒng)進(jìn)行輔助依賴型腺病毒的生產(chǎn)。經(jīng)過拯救,擴(kuò)增和大量擴(kuò)增三大步驟后收集細(xì)胞,采用氯化銫不連續(xù)密度梯度離心及透析純化病毒,經(jīng)濃度和純度檢測得到了高濃度高純度的HD-Ad-ZNF403-shRNA病毒載體。
  為檢測該載體的RNA干擾效率,采用不同濃度的HD-Ad-ZNF403-shRN

10、A和無效應(yīng)HD-Ad-shRNA-control對ZNF403表達(dá)水平高的Hep-2和HEK293細(xì)胞進(jìn)行感染,Realtime PCR檢測結(jié)果顯示HDAd-ZNF403-shRNA對ZNF403內(nèi)源性mRNA表達(dá)水平有顯著高效的干擾抑制效應(yīng)。50MOI為用量最小且干擾效果最明顯的載體濃度。Western blot檢測說明在50MOI時,內(nèi)源性ZNF403蛋白表達(dá)完全缺如,干擾效果好。同時結(jié)果顯示,HDAd-ZNF403-shRNA不影

11、響LCRG1的表達(dá),證實了其RNA干擾的特異性。
  [ZNF403表達(dá)抑制后的腫瘤生物學(xué)特性研究]
  采用HD-Ad-ZNF403-shRNA和無效應(yīng)HD-Ad-shRNA-control對Hep-2和HEK293細(xì)胞分別進(jìn)行感染(50 MOI),24小時后,經(jīng)過Realtime PCR驗證其內(nèi)源性ZNF403表達(dá)抑制效果后,進(jìn)行后續(xù)腫瘤生物學(xué)功能研究實驗。采用BrdU標(biāo)記細(xì)胞增殖Elisa方法,結(jié)果顯示ZNF403缺失

12、在體內(nèi)顯著抑制細(xì)胞增殖活動,該結(jié)果得到了體外裸鼠成瘤實驗的證實。此外,軟瓊脂集落形成實驗提示ZNF403缺失對腫瘤細(xì)胞非停泊依賴性生長有明顯損傷抑制效應(yīng);同時,細(xì)胞劃痕試驗顯示ZNF403缺失亦對腫瘤細(xì)胞的遷移活動具有抑制效應(yīng)。綜合以上研究結(jié)果,初步揭示ZNF403缺失能在體內(nèi)體外均具有抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng),并能顯著降低喉癌細(xì)胞的惡性表型。
  [ZNF403在細(xì)胞周期中的作用機(jī)制研究]
  首先采用生物信息學(xué)軟件ELM對ZN

13、F403蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析預(yù)測,發(fā)現(xiàn)存在多個與細(xì)胞周期相關(guān)的結(jié)構(gòu)域,如RB LXCXEmotif, Cyclins結(jié)合位點,PCNA結(jié)合位點等,提示ZNF403可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期對細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。繼而采用碘化丙碇(PI)標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測ZNF403基因表達(dá)抑制后對細(xì)胞各周期的影響。結(jié)果表明,ZNF403基因表達(dá)抑制能導(dǎo)致G2/M阻滯,并輕度影響S期的進(jìn)程。當(dāng)采用不同劑量的HD-Ad-ZNF403-shRNA的感染細(xì)胞時,Z

14、NF403的缺失導(dǎo)致的細(xì)胞周期G2/M期阻滯呈劑量相關(guān)效應(yīng)。同時不同時間點的分析發(fā)現(xiàn)ZNF403的缺失對細(xì)胞周期的影響為非一過性的短期細(xì)胞反應(yīng),而是穩(wěn)定的G2/M阻滯作用。此外,BrdU標(biāo)記的動態(tài)細(xì)胞周期進(jìn)程分析進(jìn)一步驗證了ZNF403的缺失導(dǎo)致的G2/M期阻滯。
  為了揭示ZNF403在細(xì)胞周期調(diào)控中的分子機(jī)制,采用高通量精確的人類細(xì)胞周期Realtime PCR array,全面比較ZNF403缺失后84個關(guān)鍵細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)

15、控基因的表達(dá)水平變化,提示以P21,MCM2,ATM,MRE11A為代表的多個細(xì)胞周期基因RNA水平發(fā)生顯著改變。同時上述4個基因的表達(dá)變化在蛋白水平亦得到證實。該研究結(jié)果合理解釋了ZNF403表達(dá)抑制對細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng),首次報道了ZNF403在細(xì)胞周期中的重要功能,并初步對其在細(xì)胞周期中的調(diào)控分子機(jī)制進(jìn)行了探討。
  [ZNF403基因啟動子區(qū)的預(yù)測,克隆,分離鑒定及其調(diào)控元件的初步分析]
  首先利用多個生物信息學(xué)軟件

16、預(yù)測ZNF403基因CpG島及其啟動子區(qū)域。經(jīng)在線程序CpGplot,Methprimer,F(xiàn)irstEF,Gene2 promoter和NNPP的啟動子預(yù)測分析,并結(jié)合TSSs預(yù)測、CpG島預(yù)測結(jié)果,初步認(rèn)為ZNF403基因啟動子位于(-1465,+199)較長區(qū)間內(nèi),并選取該1646 bp片段構(gòu)建一系列5'-或3'-端缺失的啟動子片段熒光素酶報告基因載體,經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞,雙熒光素酶活性檢測,結(jié)果表明ZNF403基因核心啟動子定位于(

17、-926~-682)區(qū)間。采用MatlnspectorV2.2和TESS軟件搜索轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,顯示核心啟動子區(qū)存在AHR,E2F1等重要調(diào)控元件,同時保守進(jìn)化足跡軟件ECR發(fā)現(xiàn)AHR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點高度保守地同時存在于小鼠的5'端調(diào)控區(qū)和人ZNF403基因啟動子區(qū)。采用AHR刺激物TCDD處理細(xì)胞,并檢測啟動子活性變化,結(jié)果顯示TCDD處理的細(xì)胞啟動子活性上升,這表明TCDD對ZNF403的表達(dá)調(diào)控可能是通過其啟動子區(qū)域的AHR結(jié)合

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