抗VWF-A3區(qū)特異性單抗SZ-123單鏈抗體的制備和生物學特性研究.pdf

1、研究背景：
　　 血栓性疾病嚴重威脅著人類的健康，血栓形成機制的研究是醫(yī)學科學領域重大課題之一。動脈血栓是造成90％以上的心肌梗死、80％腦卒中的主要原因，動脈栓塞性心血管疾病一直是發(fā)達國家首位的死亡原因。血小板在血栓形成特別是動脈血栓形成中起著重要作用。因此抗血小板治療是預防和治療血栓性疾病的重要措施。臨床廣泛使用的經典抗栓藥物如第一代的阿司匹林，噻氯吡啶等，可相應地抑制血小板活化過程中，由血栓烷A2(TXA2)和二磷酸腺苷(

2、ADP)介導的單一步驟，具有預防血栓形成的作用，第二代血栓性藥物是以阻斷血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa與纖維蛋白原(Fg)結合為主要機制。近年來針對動脈血栓形成早期階段的研究，其中膠原-血管性血友病因子(vonWillebrandfactor，vWF)-GPⅠb軸各分子間相互作用的分子機制及抗血栓治療新靶點的研究已成為血栓與止血領域中的熱點和前沿科學問題之一。由于針對膠原-vWF-GPⅠb軸來阻止血小板的早期

3、粘附和活化，具有更早、更好的抗栓活性，并減少出血危險性，形成新一代的抗栓藥物，因此具有更為廣闊的應用前景。趙益明等之前報道了一株特異性針對vWF-A3區(qū)的單克隆抗體（monoclonalantibody，mAb）SZ-123，該單抗不僅能抑制vWF與膠原的結合，還能抑制瑞斯托霉素誘導的血小板聚集（血小板膜糖蛋白GPⅠb結合于vWF-A1區(qū)），這一結果提示vWF-A3區(qū)膠原結合部位可能動態(tài)調節(jié)vWF-A1區(qū)的功能。此外，SZ-123抗體已

4、經證實在猴體內具有抗栓活性。抗vWF-A3區(qū)特異性單抗SZ-123不但能夠抑制vWF-A3區(qū)與膠原結合，而且抑制瑞斯托霉素誘導的血小板聚集。現己排除了SZ-123與vWF-A1區(qū)的作用，有假設提出是由于mAbS2-123與vWF-A3作用的同時影響了vWF-A1區(qū)的空間構像，改變了其空間結構，進而影響了vWF-A1區(qū)與血小板的結合，從而產生抗栓的作用。因此，制備分子量較小的單鏈抗體，更有利于從蛋白質空間結構上解釋SZ-123的作用機制，

5、這也是制備S2-123單鏈抗體的重要意義所在。
　　 目的：
　　 本研究旨在利用基因工程手段制備相對于抗vWF-A3區(qū)特異性單抗SZ-123分子量較小的單鏈抗體，通過原核和真核表達以及體外生物學功能實驗驗證其是否具有與SZ-123相似的功能活性，從而從蛋白質空間結構上解釋單抗SZ-123與vWF不同功能結構域相互作用的獨特機制，為下一步鼠源單抗SZ-123的人源化和更深一步探討單抗SZ-123的抗栓機制提供理論依據，同

6、時也為將來開發(fā)基于單抗S2-123的抗栓藥物奠定基礎。
　　 方法：
　　 (1)首先用RT-PCR方法擴增單抗SZ-123重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，并用Over-lapPCR方法將重鏈和輕鏈與linker序列拼接成單鏈抗體(SZ-123ScFv)，構建S2-123ScFv原核表達載體并轉化到大腸桿菌，完成SZ-123ScFv的原核表達，對其濃縮，然后用ELISA，Westernblot等方法驗證SZ-123ScFv的免疫原

7、性。
　　 (2)首先用RT-PCR方法擴增單抗SZ-123重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，并用Over-lapPCR方法將重鏈和輕鏈與linker序列拼接成單鏈抗體(S2-123ScFv)，構建單抗S2-123ScFv基因真核表達載體pSectag/SZ-123ScFv，經轉染和篩選后，并在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中獲得表達，完成SZ-123ScFv的真核表達，對其濃縮，然后用SDS-PAGE，WestemBlot等方法驗證SZ-12

8、3ScFv的免疫原性。
　　 (3)通過膠原結合抑制試驗驗證SZ-123單鏈抗體的功能活性：以人胎盤Ⅲ型膠原包板，加入vWF純品后，再加入原核與真核表達的濃縮純化后的蛋白孵育，最后加入辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)標記的兔抗人vWF多克隆抗體，四甲基聯苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)顯色后，酶標儀讀取吸光度值(OD)。
　　 (4)通過瑞斯托霉素誘導的血小板聚

9、集實驗驗證SZ-123單鏈抗體的功能活性：抽取健康人檸檬酸鈉抗凝的靜脈血，分離得到富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。加入瑞斯托霉素誘導，在血小板聚集儀上檢測其抑制血小板聚集功能。
　　 結果：
　　 SZ-123ScFv的原核表達：VH、VL可變區(qū)基因符合小鼠抗體可變區(qū)特征，SZ-123ScFV基因拼接正確。表達產物除少量為分泌型外，主要以包涵體形式存在，表達量占菌體蛋白的20％。經過變性和復性后，獲得具有

10、生物活性的單鏈抗體片段。其有一定的抑制瑞斯托霉素誘導的血小板聚集功能(P＜0.05)，差異具有統計學意義。
　　 SZ-123ScFv的真核表達：將780bp拼接后的ScFv插入真核表達載體pSectag-123ScFv，經DNA測序鑒定正確，成功構建了pSectag/Sz-123ScFv，將pSectag/SZ-123ScFv轉染到中國倉鼠卵巢細胞(ChineseHamsterOvary，CHO)后獲得目的蛋白表達，SDS-P

11、AGE和WesternBlot檢測表明目的蛋白分子量約為45kD。生物學功能試驗結果顯示SZ-123ScFv能夠劑量依賴性抑制vWF與in型膠原的結合，且能抑制瑞斯托霉素誘導的血小板聚集。與單抗SZ-123相比，其抑制作用有所降低。
　　 結論：
　　 (1)成功地構建了SZ-123單鏈抗體基因原核表達載體pET20b(+)-123ScFv，導入大腸桿菌中，經誘導表達完成了其原核的表達。該小分子抗體具有特異結合vWF-A

12、3區(qū)的能力。
　　 (2)成功地構建了SZ-123單鏈抗體基因真核表達載體pSectagSZ-123ScFv，并轉染到CHO細胞后，篩選出轉染成功的單克隆細胞，完成了其真核的表達。
　　 (3)原核表達的單鏈抗體有較弱的抑制瑞斯托霉素誘導的血小板聚集功能。真核表達的單鏈抗體具有抑制膠原與vWF結合和抑制瑞斯托霉素誘導的血小板聚集的功能，但與單抗SZ-123相比，其活性有所下降。
　　 (4)SZ-123單鏈抗體的