凋亡抑制基因c-FLIP的RNA干擾對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株MG-63生物學(xué)活性的影響.pdf

1、背景：
　　骨肉瘤是臨床上最為常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，多見于兒童和青少年，好發(fā)于血運(yùn)豐富的長(zhǎng)骨干骺端，具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移發(fā)生率早、病情進(jìn)展迅速且病死率高等特點(diǎn)，常導(dǎo)致臨床治療的失敗和患者的死亡[1]。目前有研究認(rèn)為細(xì)胞的增殖與凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著十分重要的作用；凋亡途徑的受阻也可使細(xì)胞耐受放療、化療的刺激。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為了一種新的殺傷腫瘤細(xì)胞的治療策略。細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡域樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白c-

2、FLIP（Cell Fas-associated death domain-like IL-1 beta converting enzyme inhibitory protein,c-FLIP)是一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，屬于抗凋亡家族的新成員，特異性的表達(dá)于惡性黑色素瘤、Kaposi瘤、大腸癌及非霍奇金淋巴瘤中，具有控制細(xì)胞凋亡和分裂的雙重作用[2]。由于它所具有的特異性表達(dá)以及促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的功能，使之成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。
　

3、　目的：
　　檢測(cè)c-FLIP在骨肉瘤組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系；觀察骨肉瘤細(xì)胞MG-63中c-FLIP表達(dá)下調(diào)對(duì)該細(xì)胞增殖、凋亡活性的影響。
　　方法：
　　1．收集47例臨床資料完整石蠟包埋的骨肉瘤腫瘤標(biāo)本，25例骨軟骨瘤標(biāo)本，8例正常的骨組織標(biāo)本，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)c-FLIP蛋白的表達(dá)，分析c-FLIP的表達(dá)與骨肉瘤分化程度、組織類型、淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系；
　　2．設(shè)計(jì)制備多對(duì)針對(duì)c

4、-FLIP基因的小干擾片段，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞株MG-63；熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率；采用RT-PCR、Westernblot分別檢測(cè)在mRNA和蛋白水平上c-FLIP的表達(dá)，篩選出沉默效果最好的siRNA；
　　3．轉(zhuǎn)染沉默效率最高的siRNA，分別采用MTT法、流式細(xì)胞儀和TUNEL法檢測(cè)c-FLIP表達(dá)下調(diào)的MG-63細(xì)胞增殖、凋亡活性的變化。
　　結(jié)果：
　　1．C-F

5、LIP在骨肉瘤組的蛋白表達(dá)水平高于骨軟骨瘤組和正常組（p<0.05），c-FLIP在骨肉瘤組織中的蛋白表達(dá)水平與Ennecking分期密切相關(guān)（p<0.05）、與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分型無關(guān)（p>0.05）；
　　2．轉(zhuǎn)染針對(duì)c-FLIP基因的siRNA-3后，其導(dǎo)致的c-FLIPmRNA和蛋白的表達(dá)降低最為顯著，沉默效率最高；
　　3．MTT實(shí)驗(yàn)顯示：轉(zhuǎn)染24h后，干擾組細(xì)胞在各時(shí)點(diǎn)的光吸收值均低于對(duì)照組（P<0.0