BRAF V600E對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：通過(guò)構(gòu)建BRAF V600E真核細(xì)胞表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1，探討B(tài)RAF V600E對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1生物學(xué)行為的影響，為研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制與治療提供理論依據(jù)。 方法：采用脂質(zhì)體法將重組的pCMV-Myc/BRAFV600E質(zhì)粒(突變型BRAF基因)轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系Panc-l，通過(guò)G418篩選出BRAF V600E的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，并用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及免疫印跡(West

2、ern blot)的方法加以驗(yàn)證，同時(shí)以轉(zhuǎn)染pCMV-Myc/BRAF<'w>(野生型BRAF基因)的Panc-1細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以轉(zhuǎn)染空載體的Panc-1細(xì)胞作為空白對(duì)照；三組細(xì)胞分別在置于含G418、10﹪FBS的DMEM培養(yǎng)液中，并向其中加入2mM谷胺酰氨以及青霉素、鏈霉素使其濃度為100U/mL，于37℃、5﹪CO<,2>的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MTT實(shí)驗(yàn)：每組約2，000細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，在37℃、5﹪CO<,2>的培養(yǎng)箱

3、中培養(yǎng)。分別與Oh、24h、48h和72h取出細(xì)胞，每孔加10μL MTT染液，在37℃、5﹪CO<,2>的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后離心，再加入二甲基亞砜150μL.孔。置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Elx-800型)下測(cè)定波長(zhǎng)570nm時(shí)的光密度(OD)值，比較三組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析：每組約1x10<'6>細(xì)胞接種于50mL的培養(yǎng)瓶中，先加入100μLRNA酶A，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行PI染色，37℃、5﹪CO<,2>孵育細(xì)胞30min，用流

4、式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。遷移試驗(yàn)：每組約lx10<'5>細(xì)胞接種于Transwelldx室的上室(1009L含G418、10﹪FBS的DMEM培養(yǎng)液)；Transwelldx室的下室加入600μL含G418、10﹪FBS的DMEM培養(yǎng)液；然后將上室置于下室中，在37℃、5﹪CO<,2>條件下孵育6h；取出上室，用棉簽拭去殘留在濾膜上室表面的殘留細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗后用4﹪多聚甲醛固定，蒸餾水洗滌，HE染色，顯微鏡(200X)下計(jì)數(shù)遷

5、移到濾膜下室表面的細(xì)胞。侵襲試驗(yàn)：將Matrigel置于Transwelldx室的上室濾膜上，37℃條件下孵育30min，待Matrigel形成膠：每組約1x10<'5>細(xì)胞接種于Transwell小室的上室(100μL含(3418、10﹪FBS的DMEM培養(yǎng)液)，接種細(xì)胞數(shù)約1×10<'5>個(gè)，每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔；Transwell小室的下室加入600μL含NIH 3T3成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液；然后將上室置于下室中，在37℃、5﹪﹪CO

6、<,2>條件下孵育6h；然后將上室置于下室中，在37℃、5﹪CO<,2>條件下孵育6h；取出上室，用棉簽拭去殘留在濾膜上室表面的Matrigel膠，經(jīng)PBS清洗后，用4﹪多聚甲醛固定，蒸餾水洗滌，HE染色，顯微鏡(200×)下計(jì)數(shù)遷移到濾膜下室表面的細(xì)胞。軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)：每組約2，000細(xì)胞于60mm底層為0.9﹪的瓊脂糖和頂層為0.45﹪的瓊脂糖的培養(yǎng)皿中，在37℃、5﹪CO<,2>的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d：最后在顯微鏡下(20X)計(jì)

7、數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，并且計(jì)算克隆形成率。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在0、24h時(shí)，三組細(xì)胞的A<,570>值沒(méi)有明顯差別；在48、72h時(shí)，轉(zhuǎn)染BRAF<'V006E>的Pane-1細(xì)胞的A<,570>值比轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體BRAF<'w>的Pane-1細(xì)胞的A<,570>值明顯增大。 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析結(jié)果：轉(zhuǎn)染BRAF<'V600E>的Pane-1細(xì)胞的平均細(xì)胞凋亡率為(0.27±0.06)﹪，而轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體、BRAF<'w

8、>的Pane-1細(xì)胞的為(1.854±0.16)﹪和(1.904±0.24)﹪，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)染BRAF<'V600E>的Pane-1細(xì)胞的平均遷移細(xì)胞數(shù)為75.67±3.79，而轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體、BRAF<'w>的Pane-1細(xì)胞的為60.674±5.17和61.00±2.48，轉(zhuǎn)染BRAF<'V600E>的Pane-1細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)。 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)染BKAF<'

9、V600E>的Pane-1細(xì)胞的穿透MaWigel膠的平均細(xì)胞數(shù)為62.00±4.13，而轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體、BRAF<'w>的Pane-1細(xì)胞為46.004±2.82和48.00±2.82，轉(zhuǎn)染BRAF<'V600E>的Pane-1細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)。 軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)染BRAF<'V600E>的Pane-1細(xì)胞的克隆形成率為(9.92±0.32)﹪，而轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體、BRAF<'w>的Pane-1細(xì)