Cbl-b基因沉默對TRP-2肽疫苗免疫小鼠淋巴細(xì)胞體外殺傷B16F10黑色素瘤細(xì)胞的影響.pdf

1、惡性黑素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤，臨床上迫切需要新型的治療策略。治療性疫苗是一種極具發(fā)展前景的生物治療方法，但目前臨床有效率仍較低。近年來研究發(fā)現(xiàn)泛素連接酶Cbl-b是調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的關(guān)鍵分子，直接參與了T細(xì)胞的活化及免疫耐受過程，在避免免疫無能、維持外周T細(xì)胞耐受力方面具有重要作用。本文首先構(gòu)建Cbl-b基因特異性siRNA和shRNA真核表達(dá)載體，篩選siRNA高效轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染經(jīng)肽疫苗體內(nèi)免疫過的小鼠原代淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞

2、Cbl-b基因沉默，進(jìn)而檢測小鼠原代淋巴細(xì)胞體外免疫活性狀態(tài)及細(xì)胞因子分泌情況的改變，并探討肽疫苗免疫淋巴細(xì)胞和B16F10黑素瘤細(xì)胞系體外共培養(yǎng)時，Cbl-b沉默對淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞作用的影響。
　　第一部分:Cbl-b基因ShRNA干擾載體的構(gòu)建及效果評價
　　目的:構(gòu)建小鼠Cbl-b基因RNA干擾(RNAi)的真核表達(dá)質(zhì)粒，并初步鑒定其干擾效果，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:根據(jù)GenBank提供的Cbl-b

3、 cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成4對短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)DNA序列，克隆至載體PGPU6/GFP/Neo構(gòu)建重組質(zhì)粒，并予以DNA測序鑒定。重組干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功后，將干擾質(zhì)粒與Cbl-b過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48h通過實(shí)時熒光定量PCR法及蛋白質(zhì)印記法檢測各質(zhì)粒對Cbl-b基因的表達(dá)抑制效應(yīng)。
　　結(jié)果:測序分析證實(shí)四對shRNA寡核苷酸序列分別成功插入至shRNA真核表達(dá)載體PGPU6/GFP/Neo中，將構(gòu)建成功的PGP

4、U6/GFP/Neo-shRNA質(zhì)粒與Cbl-b的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，通過熒光實(shí)時定量PCR法及westernblotting發(fā)現(xiàn)四條shRNA序列對Cbl-b的表達(dá)均有一定的抑制效應(yīng)，其中以1號shRNA序列對Cbl-b表達(dá)的抑制程度最高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建并篩選出沉默效應(yīng)最高的Cbl-b shRNA真核細(xì)胞表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究Cbl-b沉默后作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分:小鼠原代淋巴細(xì)胞

5、轉(zhuǎn)染方式選擇
　　目的:探討小鼠原代淋巴細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染的有效方法。
　　方法:從小鼠脾臟和淋巴結(jié)分離原代淋巴細(xì)胞，優(yōu)化培養(yǎng)體系，采用siRNA+Lipofectamine2000、慢病毒載體+polybrane、慢病毒載體+EnvirusTM-LV及siRNA+EntransterTM-R四種方式轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞術(shù)檢測進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率評價。
　　結(jié)果:采用上述4種轉(zhuǎn)染放方法介導(dǎo)轉(zhuǎn)染小鼠原代

6、淋巴細(xì)胞，慢病毒+polybrane轉(zhuǎn)染后96小時熒光顯微鏡下只可見稀疏熒光信號，轉(zhuǎn)染效率低于5％;脂質(zhì)體、慢病毒+ EnvirusTM-LV幾乎未見明顯熒光信號，而采用
　　siRNA+EntransterTM-R轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下熒光信號明顯強(qiáng)于前三者，采用EntransterTM-R轉(zhuǎn)染100及50 nmol/L siRNA，24 h后轉(zhuǎn)染效率分別為43.1％和22.8％:
　　結(jié)論: siRNA+ Entra

7、nsterTM-R4000可有效轉(zhuǎn)染小鼠原代淋巴細(xì)胞。
　　第三部分:Cbl-b基因沉默聯(lián)合肽疫苗對小鼠原代淋巴細(xì)胞體外殺傷B16F10黑素瘤細(xì)胞作用的影響
　　目的:觀察Cbl-b基因特異性小干擾RNA(siRNA)沉默Cbl-b基因?qū)τ谛∈笤馨图?xì)胞免疫活性影響。
　　方法:用SVY肽疫苗體內(nèi)免疫C57BL/6小鼠，取脾和淋巴結(jié)梯度離心分離淋巴細(xì)胞，體外用SVY肽和IL-2刺激淋巴細(xì)胞增殖，應(yīng)用Entranste

8、rTM-R4000將Cbl-b基因特異性SiRNA轉(zhuǎn)染小鼠原代淋巴細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)試劑盒檢測淋巴細(xì)胞增殖程度，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測上清中INF-γ及TNF-α的分泌量;CCK8法檢測混合培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞對B16F10黑素瘤細(xì)胞的殺傷活性。
　　結(jié)果:特異性Cbl-b siRNA能有效沉默淋巴細(xì)胞Cbl-b基因;轉(zhuǎn)染48 h后，CCK-8試劑盒檢測Cbl-b siRNA轉(zhuǎn)染組、NC轉(zhuǎn)染

9、組的吸光度值分別為1.246±0.063和0.906±0.039，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)染后淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中INF-γ分泌量，轉(zhuǎn)染組為95.80±17.85，轉(zhuǎn)染陰性對照組為49.92±9.89，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)染后淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的分泌量轉(zhuǎn)染組為62.23±4.409，顯著高于轉(zhuǎn)染陰性對照組32.29±2.099，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;淋巴細(xì)胞殺傷活性檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組殺傷活性明顯高于轉(zhuǎn)染陰性對照組。
　　結(jié)論:利用特異